高分辨飛行時間質譜法快速篩查韭菜中腐霉利殘留

俞璐萍， 王馨瑜， 王偉， 趙月鈞， 劉臻， 徐冰潔， 楊晨曦

(綠城農科檢測技術有限公司，浙江 杭州 310051)

韭菜味道鮮美，香味獨特，富含有維生素C、維生素B1、纖維素等營養成分。但韭菜種植過程中韭蛆、灰霉病等病蟲害多發，需要施用農藥來防治病蟲害以減少損失，其中最常使用的農藥是腐霉利。腐霉利是一種低毒性殺菌劑，能有效防治作物的灰霉病、菌核病等[1]，但由于不科學的使用方法以及采摘安全間隔期未到等，使韭菜中腐霉利超標情況頻頻發生。葉菜類蔬菜的保鮮期較短，一般只有2～3 d，目前我國對蔬菜中腐霉利的檢測常使用氣相色譜法[2-3]、氣相色譜-質譜法[4-6]等檢測方法，但這些檢測方法具有過程復雜、成本高、預處理時間長等缺點，檢測周期遠超蔬菜保鮮期，無法實現快速、高通量的陽性樣品篩選。

飛行時間質譜儀(TOF-MS)的概念最早是在1946年由William提出的[7]，是通過離子在一定距離真空無場區內按不同質荷比以不同時間到達檢測器，從而建立質譜圖的質譜儀。與傳統的氣相質譜法EI源的電離方式相比，飛行時間質譜能通過全譜精確質量數據的分析，提高化合物篩查的可靠性。但由于早期技術不成熟，分辨率低等原因未能得到廣泛的應用[8]。隨著科技的發展，分辨率、采集速率等問題得到解決，TOF-MS開始在多領域得到使用[9-11]。

本試驗使用的TAPI-TOF 1000是基于原位電離離子化技術和飛行時間質譜技術研發，用于食品快速篩查的國產儀器，其核心的高分辨飛行時間質譜技術具有完全自主知識產權。電離源在質譜儀中有重要地位，原位電離離子化技術可在常壓下同時廣譜化及識別樣品中不同種類的化學成分[12]，與檢測腐霉利常用的電子轟擊源(EI源)相比，預處理更簡單，通過測量離子在真空中的漂移時間通過分子量，具有分析速度快、檢測質量寬的優勢。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TAPI-TOF 1000飛行時間質譜(廣州禾信儀器股份有限公司)，TQ 8040氣相色譜-串聯質譜聯用儀EI源(SHIMADZU)，BSA2202S分析天平(10 mg，德國Sartorius公司)，EUFO-945616渦旋混合器(TALBOYS公司)，ST16R高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific)。

腐霉利標準溶液(1 000 μg·mL-1，上海市農藥研究所有限公司，CAS號32809-16-8)，三唑磷標準溶液(1 000 μg·mL-1，上海市農藥研究所有限公司，CAS號24017-47-8)。

乙腈(色譜純，TEDIA試劑公司)；無水硫酸鎂，氯化鈉(分析純，上海凌峰化學)；C18、PSA吸附劑(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

1.2 樣品制備

取適量有代表性韭菜樣品的可食用部分，用均質機充分粉碎混勻，密閉保存并標明標記。用電子天平稱取2 g均質后的樣品，于15 mL離心管中，加入2 mL乙腈后，振蕩混勻1 min。加入0.8 g無水硫酸鎂和0.2 g氯化鈉，振蕩1 min，8 000 r·min-1離心5 min，取1 mL上清液，加入25 mg PSA、150 mg無水硫酸鎂、25 mg C18，振蕩1 min，8 000 r·min-1離心5 min，取上清液待上機檢測，自動進樣器進樣。

1.3 儀器條件

1.3.1 飛行時間質譜條件

離子模式為正離子模式；載氣為氦氣；流速為0.8 L·min-1；載物臺溫度為180 ℃；進樣體積為10 μL。儀器穩定后，使用100 μg·L-1的三唑磷標準溶液(溶劑：乙腈)自動調諧至母離子m/z314.072 8的MIC峰面積為3.0×104(±10%)，子離子m/z162.066 7的MIC峰面積為2.0×104(±10%)；MIC峰面積比例范圍為 [1.2,1.8]；腐霉利母離子m/z284.027 0，子離子m/z256.092 0。

1.3.2 氣相色譜-串聯質譜條件

色譜柱為HP-5MS，30 m×0.25 μm×0.25 μm；進樣溫度250 ℃；柱流量1.0 mL·min-1；進樣模式為不分流進樣。升溫程序：80 ℃(40 ℃·min-1)升至250 ℃(20 ℃·min-1)升至290 ℃，保持3.75 min；載氣為氦氣(純度≥99.999%)；離子源溫度為280 ℃；進樣體積為1 μL；腐霉利定量離子對m/z283>96，電壓10 V，定性離子對m/z283>255，電壓12 V。

2 結果與分析

2.1 提取凈化

農藥殘留檢測的前處理方法主要有固相萃取法、液液萃取、QuEChERS法等[13-14]。本研究采用的是QuEChERS法，QuEChERS法操作簡便、快捷，前處理溶劑少，更適用于快速篩選。由于大多數農藥易溶于乙腈、丙酮、石油醚等有機溶劑，試驗中分別采用乙腈、丙酮、石油醚對樣品進行提取，采用丙酮提取時基質干擾較大，且水溶性太強，除水及凈化都比較困難；采用二氯甲烷提取回收率較低，且二氯甲烷毒性大，對環境不友好；采用乙腈提取回收率高，且相對色素等雜質較少，因而乙腈被廣泛應用于QuEChERS方法的提取中。

C18、PSA、GCB是QuEChERS方法常用的主要吸附劑。C18可對提取液中的非極性組分雜質進行吸附，PSA可去除部分脂肪酸、糖類等物質[15]。由于韭菜含有脂肪、糖類、揮發油等雜質，易影響回收率，所以需要使用吸附劑進行凈化。將PSA初定為30 mg，C18分別添加15、20、25、30、35 mg5級濃度，進行腐霉利濃度0.2 mg·kg-1的添加回收，統計不同C18添加量得到的回收率。由圖1可得，在C18添加量為25 mg時回收率最高。C18定為25 mg，PSA分別添加15、20、25、30、35 mg 5級濃度，進行腐霉利濃度0.2 mg·kg-1的添加回收，統計添加不同PSA量得到的回收率。由圖1可得，在PSA、C18添加量為25 mg時回收率較好，隨著吸附劑添加量的增加，回收率先上升后降低。當PSA、C18添加量不足時，雜質凈化不完全，回收率較低；當PSA、C18添加量過多時，會對目標化合物產生吸附，回收率降低。本試驗最終選定25 mg PSA、25 mg C18和150 mg無水硫酸鎂作為提取凈化劑。

圖1 不同含量PSA和C18對腐霉利回收率的影響

2.2 儀器校正

氦氣流量和熱脫附溫度等會對API-TOF/MS信號產生影響，使用100 μg·L-1三唑磷(前體離子314.072 8，產物離子162.066 7)對儀器進行質量軸校準。1 000 μg·mL-1三唑磷標準溶液使用色譜純乙腈稀釋至100 μg·L-1三唑磷標準工作溶液，進樣并進行校準，結果見圖2和3。

圖2 API-TOF/MS中三唑磷質譜圖(100 μg·L-1)

2.3 定性分析

常壓電離是現代質譜快速分析的一類離子源技術統稱。氣體密度低，在電場作用下，電子易獲得能量發生電離，TAPI-TOF 1000通過載物臺高溫(180 ℃)將樣品和溶劑氣化，通過等離子體射流裝置，使氣化樣品、溶劑、離子源內氮氣、水蒸氣等放電氣氛中存在的原子和分子，粒子之間相互碰撞，亞穩態氣體原子能量由高能量向低能量轉移，發生電離[16]。電離后，易產生化合物準分子離子峰，類似[M]+/-的離子。腐霉利分子結構式見圖4，相對分子質量為284.14。實際進樣后，腐霉利選擇前體離子284.027 0定量，產物離子256.092 0。

圖3 API-TOF/MS中三唑磷混合離子圖

根據《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2021)韭菜中腐霉利限量值為0.2 mg·kg-1，將腐霉利標準溶液配制基質標至0.2 mg·L-1進樣，質譜如圖4。進行空白韭菜基質試驗，排除樣品假陽性可能，質譜如圖5。

圖4 TAPI-TOF 1000中腐霉利標樣(0.2 mg·L-1)質譜圖及分子結構式

圖5 TAPI-TOF 1000中空白基質質譜圖

2.4 校準曲線

用空白韭菜樣品基質，配制腐霉利系列標準溶液，濃度分別為0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 mg·L-1，按照飛行時間質譜儀器條件進行分析，得到不同濃度各目標化合物的質譜圖。以標準溶液系列濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程，峰面積由儀器自動積分獲取。如表2所示，標準曲線相關系數R2為0.995 1。根據《實驗室質量控制規范食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)驗證方法標準曲線相關系數不應低于0.99，此方法標準曲線符合要求。

2.5 檢出限

現有常用氣相色譜質譜法標準腐霉利檢出限，如下表1，檢出限最低為0.01 mg·L-1。驗證本方法檢出限是否高于現有常用氣相色譜質譜法標準的果蔬檢出限，采用空白樣品添加0.010 mg·L-1濃度腐霉利，按1.3中樣品制備后飛行時間質譜檢測，結果顯示，S/N為14.3，大于3，滿足檢出限要求。

表1 本方法檢出限與國家標準檢出限的對比

2.6 回收率、精密度

根據GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》，以常見限量指標，進行精密度試驗。取2.0 g試樣6個，添加腐霉利標準溶液至0.20 mg·kg-1，按1.3節中樣品制備后飛行時間質譜檢測，檢測結果如表2所示，回收率為95.8%，變異系數為14.3%，符合試驗要求。

表2 韭菜中腐霉利校準曲線、回收率、精密度

2.7 日常樣品分析

取日常韭菜樣品50個，根據1.3，每個樣品做4個平行，對平行樣品進行處理后，取雙平行用TAPI-TOF 1000進行檢測，取雙平行用氣相色譜-串聯質譜聯用儀檢測。標準溶液濃度為0.2 mg·L-1，計算公式：

式中：w為樣品中待測組分殘留量(mg·kg-1)；S1為樣液中待測組分定量離子色譜的峰面積；V為樣品定容體積，單位為毫升(mL)；C1為標準溶液中待測組分的濃度(mg·L-1)；S2為標準溶液中待測組分定量離子色譜峰的峰面積；m為最終溶液相當的試樣質量(g)。其中，27個樣品TAPI-TOF 1000和氣相色譜-串聯質譜聯用儀均未檢出，檢出率一致；23個陽性樣品檢測，根據《GB 2763—2021食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》韭菜中腐霉利限量值為0.2 mg·kg-1，判斷超標情況結果見表3。

表3 日常陽性樣品分析結果對比

23個陽性樣品檢測結果顯示，TAPI-TOF 1000與氣相色譜質譜聯用儀測得濃度相比，相對相差范圍為1.8%～17.4%，陽性樣品超標情況一致率95.7%。其中一組檢測數值接近限量值，氣相色譜-串聯質譜法數值低于限量值，而TOF檢測結果高于限量值。從試驗數據看，飛行時間質譜(禾信TAPI-TOF 1000)能快速篩選出陽性樣品。

3 小結

基于我國自主研發的原位電離離子化技術和飛行時間質譜技術的國產儀器，建立韭菜中腐霉利的快速檢測方法。將實測數據與氣相色譜質譜聯用儀做對比，相對相差范圍為1.8%～17.4%，能比較準確得出腐霉利實測結果，證明了飛行時間質譜(禾信TAPI-TOF 1000)檢測韭菜中腐霉利的可行性，對比傳統方法，有更快速高效、樣品需求量小的優點。將該儀器運用于快速檢測，能起到快速準確篩選出陽性樣品。