siRNA靶向下調RhoA基因對慢性高眼壓小鼠視功能的保護作用

劉茜，劉長庚，李海軍，董仰曾，張穎

(河南省人民醫院/河南省立眼科醫院/河南省眼科研究所/鄭州大學人民醫院 眼科，河南 鄭州 450000)

青光眼是視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)及其在視神經內的軸突丟失造成的眼部疾病，是一種復雜的神經退行性疾病，也是全球不可逆盲的主要原因之一[1-3]。眼壓升高是導致視網膜神經節細胞及其軸突丟失的主要危險因素，視神經保護及其治療靶點的干預治療是青光眼防盲治盲的關鍵[4-5]。Rho是與Ras相關的小分子鳥苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTPase)超家族Rho家族的成員，Rho有3種異構體類型：RhoA、RhoB和RhoC[6]。Rho通路的激活會導致小梁網(trabecular meshwork，TM)收縮，并且該通路的抑制將引起TM的松弛，隨后增加流出量，從而降低眼內壓(intraocular pressure，IOP)[7]。其中，RhoA存在于培養的TM細胞，并且RhoA信號通路廣泛參與人體多種生理和疾病病理以及視神經保護過程[8]。研究表明，Y-27632能夠特異性抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶(Rho-associated kinase，ROCK)及其下游的肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)，改變人眼TM細胞的肌動蛋白結構和細胞黏附力，降低應力纖維的收縮，促進房水的外引流，降低眼壓[9]。因此，確定靶向TM細胞的機制可能有助于開發治療青光眼的有效策略。本研究擬玻璃體腔注射RhoA siRNA(siRhoA)，探討RNA干擾技術治療青光眼的可行性，為深入研究siRhoA青光眼視神經保護的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗主要材料C57小鼠由河南省實驗動物質量監督監測站提供，為無特定病原體動物，飼養于室溫24 ℃的環境中，維持明/暗12 h循環交替光照條件。靶向RhoA的小干擾RNA片段(siRhoA)和siRNA陰性對照片段由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，其中正義鏈F：5’-GAAGUCAAGCAUUUCUGUCdTdT-3’，反義鏈R：3’-dTdTCUUCAGUUCGUAAAGACAG-5’。CCK-8試劑盒購自廈門侖昌碩生物科技有限公司，地塞米松(dexamethasone，DEX)購自西安康諾化工有限公司，RhoA抗體購自Abcam公司。采用APS-2000AER視覺電生理檢查儀(德國蔡司)對受試者閃光視覺誘發電位(flash visual evoked potential，f-VEP)進行分析。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物模型建立與分組 實驗動物飼養和使用遵守“眼與視覺研究協會動物使用聲明”相關規定，經河南省立眼科醫院中心倫理審查委員會通過(HNEECA-2021-11)。實驗動物模型擬采用既往實驗建立的方法[10]。選取21只4～6周的C57小鼠(雌雄各半)，隨機分為3組(A組，B組，C組)。3組小鼠以1 g·L-1DEX持續低濃度點左眼(處理眼，DEX)，右眼接受生理鹽水持續點眼(對照眼，NS)。使用Tonopen眼壓計測量小鼠眼壓。采用定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot檢測第 28天DEX處理眼和對照眼中RhoA基因和RhoA蛋白表達量。

1.2.2玻璃體腔注射 體內轉染siRNA的配制采用既往實驗建立的方法[11]。第28天時，小鼠左眼行體內轉染實驗。以40 g·L-1水合氯醛麻醉動物，鹽酸丁卡因進行局部麻醉，體視顯微鏡下，經角鞏膜緣前約0.5 mm進行前房穿刺，放出少量房水，用25 G的微量注射器將5 μL siRNA距離角鞏膜緣1 mm處行玻璃體腔注射。其中A組(實驗組)注射siRhoA，B組(陰性對照組)注射陰性對照siRNA(NC siRNA)，C組(對照組)注射PBS緩沖液，術后于1、4、7、14、28 d測量小鼠術眼眼壓。

1.2.3視覺電生理檢查 注射后28 d對各實驗組視覺功能進行f-VEP檢測[12]，將小鼠麻醉后固定于固定架上，在暗室內使用EP1000 Pro型眼電生理檢查儀(日本Tomey公司)，于小鼠頭部后方相對應眼的螺旋釘上接作用電極，前部螺旋釘上接參考電極，接地電極不銹鋼針插入小鼠尾部上方。小鼠眼睛距離閃光刺激源10 cm，共測量3次，每次間隔5 min，取測量平均值，比較視網膜功能恢復情況。

1.2.4體內轉染效率檢測 siRhoA注射后，于第28天利用qRT-PCR檢測視網膜組織RhoA基因變化情況(其中正義鏈F：5’-CCCGTTCTATACCGGGTGAA-3’，反義鏈R：3’-CAAAAGTTTGTGGCACCCGT-5’，以β-actin基因作為管家基因，各基因的相對表達量參照2-△△Ct方法)，使用SPSS 24.0統計軟件對基因表達水平進行定量分析。采用Western blot檢測RhoA蛋白表達情況：使用勻漿器提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白變性處理10 min后，行凝膠電泳，蛋白電泳分離后轉移至PVDF膜。使用40 g·L-1的脫脂牛奶于室溫條件下封閉1 h，再經一、二抗孵育后加入顯色劑曝光，于冷CCD凝膠成像系統中拍攝掃描圖片，用Image J-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 DEX誘導實驗動物眼壓及RhoA表達量變化處理前小鼠基線眼壓為(10.26±1.52)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。生理鹽水處理眼與對照眼眼壓差異無統計學意義(F=0.209，P=0.928)。1 g·L-1DEX持續點眼可引起持續眼壓升高，眼壓在第1天即出現較高水平，持續至第28天(F=71.752，P<0.001)(圖1A)。DEX處理眼與對照眼眼壓差異有統計學意義(F時間=43.872，P時間<0.001；F組間=263.333，P組間<0.001；F交互=38.228，P交互<0.001)(圖1A)。qRT-PCR和Western blot結果顯示，DEX處理28 d后左眼視網膜組織RhoA基因(F=67.434，P=0.001)和RhoA蛋白(F=150.482，P<0.001)的表達量與對照眼相比差異有統計學意義(圖1B、C、D)。

A為0～28 d小鼠眼壓變化情況；B為qRT-PCR檢測小鼠視網膜組織RhoA基因表達量變化情況；C、D為Western blot檢測小鼠視網膜組織RhoA蛋白表達量變化；DEX代表地塞米松處理眼，NS代表生理鹽水處理眼；**P<0.01。

2.2 siRNA注射后眼壓變化情況注射siRhoA后，A組小鼠的眼壓在初期(1、4、7 d)略有下降，但與對照眼相比差異無統計學意義(P>0.05)，與B組和C組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組眼壓變化情況

2.3 siRNA注射后RhoA基因和RhoA蛋白表達量變化注射siRNA和PBS后第28天，檢測各組小鼠雙眼視網膜組織中RhoA基因和RhoA蛋白表達量。結果顯示，A組小鼠左眼中RhoA基因(F=0.004，P=0.995)和RhoA蛋白表達量(F=0.004，P=0.995)相較對照眼差異無統計學意義；B組小鼠左眼中RhoA基因(F=47.336，P=0.002)和RhoA蛋白表達量(F=37.701，P=0.004)相較對照眼有較高的表達，C組小鼠左眼中RhoA基因(F=70.141，P=0.001)和RhoA蛋白表達量(F=70.141，P=0.001)也比對照眼表達高(圖2)。

A為qRT-PCR檢測高眼壓模型小鼠玻璃體腔注射后RhoA基因表達量相較對照眼的變化；B和C為Western blot檢測高眼壓模型玻璃體腔注射治療后RhoA蛋白表達量相較對照眼的變化；DEX代表地塞米松處理眼，NS代表生理鹽水處理眼；**P<0.01。

2.4 各組小鼠的視覺功能變化玻璃體腔注射后，A組小鼠左眼f-VEP 的N波潛伏期、P波潛伏期和P波振幅逐漸恢復，相較B組和C組差異有統計學意義(P<0.05)，而B組和C組小鼠左眼f-VEP的P波和N波潛伏期延長，P波振幅降低(P<0.05)。見表2。

表2 注射后第28天與對照眼f-VEP情況的比較

3 討論

青光眼是一類影響人類和動物的復雜視神經病變。眼壓的調節對視功能至關重要，其升高仍然是青光眼發病的主要危險因素[13-14]。由于TM在維持正常房水流出和調節IOP中起關鍵作用，所以干預TM組織可能是降低IOP的重要臨床治療方式[15]。在以前的研究中，DEX顯示出誘導TM細胞中RhoA的瞬時激活[7,16]，進一步激活了下游效應器ROCK。研究表明，RhoA/ROCK在調節IOP中起重要作用，RhoA抑制劑C3轉移酶和ROCK抑制劑Y-27632能夠特異性抑制ROCK激酶及其下游的肌球蛋白輕鏈磷酸酶，改變人眼小梁細胞的肌動蛋白結構和細胞黏附力，降低應力纖維的收縮，促進房水的外引流[17-18]。基于這些，證明了DEX不僅增加了RhoA的表達，而且激活了ROCK，DEX可能通過RhoA/ROCK途徑誘導，升高眼壓，進一步表明RhoA可能作為降低眼內壓的干預因子[19-20]。

本研究通過DEX誘導慢性高眼壓小鼠模型，經qRT-PCR和Western blot檢測RhoA基因和RhoA蛋白表達量，結果顯示所有小鼠DEX誘導后眼壓升高(7、14、21、28 d)，初步構建慢性高眼壓動物模型，DEX誘導眼視網膜組織與生理鹽水處理后對照眼的RhoA基因和RhoA蛋白的表達量差異有統計學意義。王艷華等[21]研究發現，在眼部急性高眼壓大鼠模型實驗損傷后的視網膜中，RhoA蛋白表達高于正常大鼠視網膜組織，隨損傷時間的延長蛋白表達量上升；此外，在去核豬眼中RhoA介導的TM收縮導致眼壓快速升高[22]。其他研究表明，在前房注射轉化生長因子-β1后的前3 d內，RhoA的mRNA表達上調，同時也觀察到眼壓的早期升高[23]。這些結果進一步支持了RhoA與青光眼之間的關系。

此外，通過siRhoA玻璃體腔注射治療后，注射siRhoA組小鼠的RhoA基因表達量和RhoA蛋白表達量下調，且均低于NC siRNA和PBS組表達量；本研究結果顯示，siRhoA玻璃體腔注射降低DEX誘導后視網膜神經節細胞RhoA基因和RhoA蛋白表達量。與對照組相比，siRhoA更及時有效地預防了眼壓升高，表明正常小鼠和DEX處理小鼠之間IOP變化的差異可能是由于DEX誘導的TM功能障礙[7]。此外，本研究通過f-VEP檢測玻璃體腔注射后實驗動物視覺功能的情況。已有研究證實f-VEP可用于動物視神經傳導功能的監護，是客觀、可靠地評價視功能的一種方法[12,24]。f-VEP是視網膜受到閃爍光刺激后，在枕葉視皮層產生的電活動，枕皮層首先直接反映了視皮層的活動以及視皮層和其的聯系；其次，間接反映了從視網膜神經節細胞開始，以及從節細胞到中樞的視信息處理系統，尤其是中心視功能系統的狀態[25]。本研究中A、B、C組小鼠左眼的f-VEP中P波潛伏期和P波振幅與對照眼相比差異有統計學意義，表明慢性高眼壓小鼠模型的神經節細胞的丟失較多導致光敏度降低，從而導致P波幅降低、潛伏期延長視力水平低于對照眼。經siRhoA治療后，A組實驗動物N波、P波潛伏期和P波振幅逐漸恢復，雖未完全至正常水平，但相較B和C組而言，f-VEP異常減輕，表明其神經節細胞丟失可能得到改善，視覺通路神經興奮的傳導速度加快，異常組織結構與功能趨于恢復。本研究表明，利用siRhoA方法治療與TM相關的疾病是可行的，如青光眼。

本研究通過玻璃體腔注射干擾siRhoA表達，相較NC siRNA和PBS組RhoA基因和RhoA蛋白表達量降低。同時，相較陰性對照組，siRhoA組實驗動物的視覺功能恢復。本研究為青光眼基因治療的臨床應用提供了一定的理論基礎。