microRNA let-7a-3調節結直腸癌中RAB11FIP2的表達

張利蘋，董文杰，李靜文，陳璐璐

(鄭州大學第一附屬醫院 腫瘤科，河南 鄭州 450052)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是臨床上常見的惡性腫瘤，據統計2020年全球結直癌發病人數為193.2萬，占癌癥總發病人數的10.0%，居各癌種發病總人數第3位，分別是男性第三常見和女性第二常見惡性腫瘤[1-2]。目前CRC的治療手段主要有手術、化療、靶向治療及免疫治療等，但患者的預后仍較差，晚期CRC的生存率不足8%，因此有必要進一步尋找CRC的潛在治療靶標[3-4]。microRNA(miRNA)是高度保守的小非編碼RNA，約22個核苷酸，當與靶mRNA的3’-UTR中存在互補序列時，可以通過抑制mRNA翻譯和促進其降解等機制負向調節蛋白質的表達[5]。let-7家族最早從線蟲中發現[6]，是最早發現的2個microRNA之一，既往研究顯示let-7在一些惡性腫瘤中發揮抑癌作用[7]。let-7a-3是let-7基因家族的成員，位于染色體12q13.31，與let-7a-1、let-7a-2共同編碼成熟的miRNA let-7a[8]。其啟動子富含CpG二核苷酸重復序列，其表達受啟動子甲基化的表觀遺傳調控[9]。然而，目前尚不清楚CRC中是否也存在let-7a-3甲基化。本研究分析了90例CRC患者let-7a-3的DNA甲基化狀態、生物學功能及其可能的作用靶基因，并且評估了let-7a-3甲基化狀態與臨床特征之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 病例資料來源及細胞培養臨床資料購買于上海芯超生物公司，包括90例CRC患者的性別、年齡、臨床分期、腫瘤部位等臨床信息及癌和匹配的相鄰非腫瘤組織樣本。使用的CRC細胞系有HCT116、SW480、HCT15、GEO、SW620，均購買于中國科學院上海細胞庫。在37 ℃、95%濕度、體積分數5% CO2的條件下，用體積分數為10%胎牛血清和1%鏈霉素/青霉素抗生素的DMEM高糖培養基培養細胞。

1.2 分離miRNA和實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)使用Trizol試劑(Invitrogen)從對數生長期的CRC細胞系中提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒的操作說明進行逆轉錄。逆轉錄反應體系20 μL，反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。通過ABI 7500 RT-PCR系統使用FastStart Universal SYBR Green Master評估let-7a-3和RAB11家族相互作用蛋白2(Rab11 family interacting protein 2，RAB11FIP2)的表達。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。RAB11FIP2和let-7a-3的表達分別歸一化為GAPDH和U6。let-7a-3：上游5’-TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTAAA-3’，下游5’-AACGAGACGACGACAGACTTT3’。RAB11FIP2：上游5’-AGTACTCACATGCCCGATGC-3’，下游5’-CTATGGTGCCAGCCTTCAGT-3’。GAPDH：上游5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，下游5’GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT3’。U6：上游5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’，下游5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’。利用2-ΔΔCt相對定量法進行結果分析。

1.3 細胞轉染實驗所用的pre-let-7a-3前體分子和陰性對照RNA寡核苷酸購自Ambion公司。取對數生長期的CRC細胞進行轉染，轉染前1 d將細胞接種在不含抗生素的培養基中，在37 ℃、95%濕度、體積分數5% CO2的培養箱中培養。細胞生長密度達到50%時，根據操作手冊使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進行miRNA轉染。let-7a-3組和陰性對照組分別轉染let-7a-3和陰性對照RNA寡核苷酸。轉染48 h后收集細胞。

1.4 聯合亞硫酸氫鹽限制性分析法和亞硫酸氫鹽測序法檢測CRC組織let-7a-3甲基化狀態通過聯合亞硫酸氫鹽限制內切酶分析法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)和亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)分析let-7a-3的甲基化狀態。使用EpiTect Bisulfite試劑盒(Qiagen)用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA(2 μg)。從亞硫酸氫鹽修飾的DNA中擴增出包含胱抑素M啟動子區15個CpG位點的片段。使用Methprimer軟件設計BSP的引物。使用的引物是5’-TTTGGTTGG TGGTTTTTTGTAGG-3’(正義)和 5’-TATATAATTATCCCATAACAAAAC-3’(反義)。將擴增的亞硫酸氫鹽測序PCR產物克隆到 pMD18-T克隆載體(Takara)中。COBRA通過PCR產物在60 ℃下用識別序列為5’-CGCG-3’的限制性酶BstUI(New England BioLabs)消化12 h。將得到的DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳并用溴化乙錠染色。甲基化(M)與未甲基化(U)產物的比例(消化與未消化)通過密度計來測定，以確定甲基化的密度。甲基化百分比為M占M與U之和的百分數。

1.5 去甲基化劑處理為探究let-7a-3表達與甲基化之間的關系，實驗組CRC細胞系用1 μmol·L-15-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-dC)處理，對照組不進行5-aza-dC處理，各組細胞培養96 h，每日更換培養基。收集處理后的細胞行RT-PCR檢測let-7a-3表達，行COBRA實驗檢驗5-aza-dC對甲基化的作用。

1.6 流式細胞儀檢測CRC細胞凋亡利用膜聯蛋白V和碘化丙啶(annexin V-PI雙染色法)試劑盒(Biolegend)通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。收集用let-7a-3或陰性對照RNA-寡核苷酸轉染后的CRC細胞，置于1.5 mL EP管中，用PBS離心洗滌2次(1 500 r·min-1，5 min，4 ℃)，棄去上清。每管加入200 μL Binding Buffer和5 μL annexin V-FITC，室溫下孵育15 min。上機檢測前加入5 μL PI避光孵育5 min。用流式細胞儀測定凋亡細胞的比率。

1.7 錨定-非依賴性生長錨定-非依賴性生長試驗即軟瓊脂試驗，檢測let-7a-3對CRC細胞集落形成能力的影響。建立轉染let-7a-3和陰性對照的CRC細胞，24 h后用DMEM重懸細胞，取1×104個細胞置于3 g·L-1低熔點瓊脂/生長培養基中，在鋪有6 g·L-1瓊脂墊的6 cm細胞培養皿中進行培養。培養3周后，對直徑>1 mm的菌落進行計數。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測let-7a-3與RAB11FIP2靶標關系通過RT-PCR 擴增包含預測的let-7a-3結合位點的野生型(WT)RAB11FIP23’UTR片段。使用Stratagene Quik-Change定點誘變試劑盒(Stratagene)對let-7a-3靶位點進行定點誘變。對該構建體進行測序并命名為RAB-UTR-Mut。用pMIR-report熒光素酶載體構建RAB-UTR或RAB-UTR-Mut質粒(Ambion)。細胞在24孔板中培養，每個孔中以標準化轉染效率共轉染10 ng phRL-TK海腎熒光素酶載體(Promega)。500 ng RAB-UTR或RAB-UTR-Mut質粒連同10 nmol·L-1pre-let-7a-3或陰性對照也被共轉染。使用Lipofectamine 2000和Opti-MEM Ⅰ血清培養基(Life Technologies)進行轉染。使用雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega)檢測螢火蟲熒光素酶活性。歸一化相對熒光素酶活性為螢火蟲熒光素酶與海腎螢光素酶之比。

2 結果

2.1 CRC組織中let-7a-3的甲基化分析及與臨床特征之間的關系let-7a-3基因轉錄起始位點周圍跨越15個CpG位點的CpG富含區和BstUI識別序列如圖1A所示。利用COBRA對CRC組織中let-7a-3啟動子區域的甲基化進行分析，結果顯示，let-7a-3基因的啟動子甲基化在90個癌組織樣本中有71個(78.89%)呈陽性，而90個配對的相鄰癌旁組織樣本中有17(18.89%)個為陽性，且差異有統計學意義(P<0.001)。部分代表性樣本的甲基化COBRA凝膠分析如圖1B所示，條帶上方數字代表樣本編號。CRC組織let-7a-3甲基化頻率與組織來源即癌或癌旁組織有關(P<0.001)，與性別(P=0.283)、年齡(P=0.945)、臨床分期(P=0.167)和腫瘤部位(P=0.161)無關。見表1。

表1 let-7a-3甲基化狀態與臨床特征之間的關系

A為與let-7a-3的啟動子相關的CpG島圖，用于亞硫酸氫鹽測序PCR的正義和反義引物的位置用下劃線表示；B為CRC組織中let-7a-3啟動子甲基化的代表性COBRA結果，來自亞硫酸氫鹽處理的DNA的PCR產物用BstUI消化，在完全或部分消化時產生消化條帶，消化的片段對應于甲基化的DNA，條帶頂部數字代表樣本編號。

2.2 去甲基化劑5-aza-dC誘導let-7a-3表達BSP顯示CRC細胞具有廣泛的let-7a-3基因啟動子甲基化。見圖2A。RT-PCR結果顯示，用去甲基化劑5-aza-dC處理后CRC細胞let-7a-3的表達被誘導。見圖2B。COBRA結果證實用5-aza-dC處理CRC細胞會導致部分去甲基化。見圖2C。

A為CRC細胞系中let-7a-3啟動子的單個亞硫酸氫鹽測序克隆的甲基化模式，黑色和白色區域分別代表每個病例測序的菌落中甲基化和未甲基化CpG位點的百分數；B為通過 RT-PCR測定用或不用去甲基化劑5-aza-dC處理的CRC細胞系中let-7a-3的表達，*P<0.001；C為COBRA檢測證實5-aza-dC的去甲基化功能。

2.3 外源性表達let-7a-3誘導CRC細胞凋亡并導致CRC細胞錨定-非依賴性生長能力減弱對CRC細胞系進行let-7a-3或陰性對照RNA-寡核苷酸轉染，48 h后進行細胞凋亡檢測，結果顯示：與陰性對照相比，用let-7a-3處理的細胞凋亡水平更高(P<0.001)。見圖3A。使用HCT116細胞系進行錨定-非依賴性生長試驗，結果表明：與對照組相比，let-7a-3的外源表達抑制CRC細胞的不依賴貼壁能力(P<0.001)。見圖3B、C。

A為通過流式細胞儀分析轉染let-7a-3前體分子或陰性對照的細胞的凋亡百分數，每個條形上方的值代表膜聯蛋白V+/PI-和膜聯蛋白V+/PI+的分數，*P<0.001；B、C為3周后的菌落測定示例，放大倍數×400，細胞用吉姆薩染色；圖中數值為3個獨立實驗的均數±標準差。

2.4RAB11FIP2是let-7a-3的作用靶基因使用3種miRNA靶標預測算法，即miRanda、PicTar和TargetScan對CRC中let-7a-3的潛在基因靶標進行計算分析，最后選擇RAB11FIP2作為候選靶基因。為研究let-7a-3是否直接識別RAB11FIP2mRNA的3’UTR，將帶有預測的let-7a-3靶位點的序列或帶有預測靶位點的突變序列克隆到pMIR熒光素酶報告基因下游。當用let-7a-3轉染野生型或突變型載體時，與突變型載體相比，野生型載體的熒光素酶活性降低(P<0.001)。見圖4A。當野生型或突變型載體轉染陰性對照miRNA時，野生型或突變型載體之間差異無統計學意義(P>0.05)，表明let-7a-3可能在RAB11FIP2的調節中起作用。為了進一步驗證RAB11FIP2是let-7a-3的作用靶點，對用let-7a-3模擬物轉染的細胞進行RT-PCR，結果顯示，與轉染miRNA陰性對照的細胞相比，轉染let-7a-3后RAB11FIP2表達降低。見圖4B。

A為與RAB-UTR-Mut和對照組相比，RAB-UTR載體中的螢火蟲熒光素酶報告基因活性降低(*P<0.001)；B為用let-7a-3前體分子或陰性對照轉染后CRC細胞中RAB11FIP2的相對表達水平。

3 討論

CRC的發展是一個多步驟的過程，包括一系列遺傳、組織學和形態學改變。近年來年輕人群CRC發病率增加，這與多種因素相關，如不良生活方式、肥胖、腸道炎癥、癌癥史、CRC家族史等[10-11]。高達30%的CRC患者存在轉移CRC，需要進行全身治療[12]。靶向治療已經成為CRC患者全身治療的重要手段，如靶向血管內皮生長因子的貝伐珠單抗、靶向表皮生長因子受體的西妥昔單抗等靶向藥物已經在臨床上廣泛應用，并且顯著改善患者的預后。因此，有必要對CRC的發生機制進行研究，以期探索新的基因靶點。

miRNA及其靶mRNA在癌癥中差異表達，一些miRNA可作為癌基因或腫瘤抑制因子。既往研究顯示miRNA在細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡、代謝和發育等多種生物學過程中起關鍵作用[13]。let-7a-3是miRNA家族的成員，相關研究顯示let-7a-3低甲基化與疾病不良預后相關。例如在肺腺癌中let-7a-3低甲基化促進了基因的表觀遺傳再激活[9,14]。慢性髓系白血病中let-7a-3低甲基化與疾病進展相關[15]，同樣地，let-7a-3低甲基化預示急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征患者預后不良[16-17]。而在某些疾病中let-7a-3高甲基化，如在乳腺癌中let-7a-3廣泛甲基化[18]。同時，let-7a-3的啟動子高甲基化可能通過靶向UHRF1/DNMT1參與糖尿病腎病的發展[19]。上述研究結果表明不同疾病中let-7a-3甲基化水平具有差異性，對疾病的調控作用也不同，其作用可能具有組織特異性或腫瘤特異性。

目前，CRC中let-7a-3的甲基化狀態尚不清楚，本研究分析了90例CRC患者let-7a-3的甲基化狀態，結果顯示90例癌組織樣本有71例(78.89%)樣本let-7a-3甲基化呈陽性，而配對癌旁組織樣本陽性率僅為18.89%，表明let-7a-3啟動子甲基化在CRC組織中是一種常見情況。這與上皮性卵巢癌中也可以檢測到let-7a-3高甲基化類似，在卵巢癌中let-7a-3的高甲基化與胰島素樣生長因子-Ⅱ的低表達和患者的良好預后有關[20]。用去甲基化劑5-aza-2-dC處理CRC細胞后let-7a-3表達上調，COBRA證實用5-aza-dC處理會導致CRC部分去甲基化，上述結果共同表明去甲基化可以誘導let-7a-3的表達。細胞凋亡和錨定-非依賴性生長試驗發現let-7a-3過表達時促進細胞凋亡并抑制體外貼壁非依賴性生長。對臨床數據進行分析，發現let-7a-3的高甲基化與組織來源有相關性，但與性別、年齡及臨床分期等因素無關。let-7a-3在CRC中的作用機制尚不清楚，本研究利用miRNA靶標預測程序選擇RAB11FIP2為候選靶基因，先前研究表明RAB11FIP2參與質膜蛋白的內體運輸，促進細胞運動，在CRC中高表達，促進腫瘤遷移和侵襲[21-22]。使用克隆到熒光素酶基因下游的RAB11FIP2的3’-UTR的報告基因分析顯示在let-7a-3存在時熒光素酶活性降低，說明let-7a-3可能是RAB11FIP2的直接調節因子。在轉染let-7a-3后，CRC細胞中RAB11FIP2表達下調，進一步驗證了let-7a-3對RAB11FIP2具有調控作用。綜上可以推理在CRC中let-7a-3的表觀遺傳沉默可能使RAB11FIP2上調從而導致腫瘤的發生、發展。本研究的局限性在于未從臨床樣本中檢測RAB11FIP2蛋白水平，未研究let-7a-3甲基化與患者臨床預后的關系，未來可進行相關研究。

總之，在結直腸癌中let-7a-3啟動子甲基化是一個常見事件，去甲基化可誘導let-7a-3表達。let-7a-3表達上調時誘導細胞凋亡，抑制細胞錨定非依賴性生長。let-7a-3通過靶向RAB11FIP2基因在CRC的發生中起一定作用，提示let-7a-3可能是CRC治療的潛在生物標志物。