腦卒中患者氯吡格雷抵抗與CYP2C19基因多態(tài)性和P2Y12受體的相關(guān)性研究*

杜安妮，林 牧，蔡 銳

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥理教研室，貴州 遵義 563000；2.貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000；3.遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

腦卒中是臨床上較常見的腦血管疾病，多發(fā)病于45 歲以上的中老年人[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有1 100萬例腦卒中患者，每年新發(fā)約200 萬例，死亡150萬例[2]。目前，我國(guó)老齡化問題日益嚴(yán)重，腦卒中發(fā)病率呈逐年攀升趨勢(shì)[3]。在腦卒中治療過程中，常需要長(zhǎng)期服用血小板P2Y12受體拮抗劑——氯吡格雷，用于阻礙二磷酸腺苷(ADP)介導(dǎo)的血小板膜糖蛋白(GP) Ⅱb/Ⅲa 復(fù)合物活化及ADP與血小板P2Y12受體的結(jié)合，以達(dá)到抑制血小板聚集、改善血流動(dòng)力學(xué)的目的[4]。

在使用氯吡格雷治療過程中，部分患者會(huì)表現(xiàn)出低反應(yīng)、無反應(yīng)或耐藥性的現(xiàn)象，稱為氯吡格雷抵抗。在研究氯吡格雷抵抗的各種機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450酶同工酶系統(tǒng)中的CYP2C19基因是氯吡格雷代謝過程中的關(guān)鍵酶[5]。而CYP2C19基因具有高度多態(tài)性，根據(jù)藥物代謝快慢可將CYP2C19基因型分為 4 種代謝表型：超快代謝型(UM)*17/*17、 *1/*17，快代謝型(EM)*1/*1，中間代謝型(IM)*1/*2、 *1/*3，慢代謝型(PM)*2/*2、*2/*3、 *3/*3[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 PM患者不良心腦血管事件的發(fā)生率明顯高于EM患者[7]，PM患者體內(nèi)氯吡格雷的活性轉(zhuǎn)化率降低，活性代謝產(chǎn)物減少，最終導(dǎo)致藥效減弱[7-8]。而UM*17基因在中國(guó)人群中突變頻率約為2%[9]，該基因型會(huì)導(dǎo)致酶活性過度表達(dá)，患者在服藥后可能會(huì)出現(xiàn)氯吡格雷抗血小板療效增強(qiáng)，進(jìn)而增加其出血風(fēng)險(xiǎn)。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，普遍認(rèn)為CYP2C19基因第681位堿基由G→A突變(CYP2C19*2)是影響氯吡格雷抗血小板聚集及療效的重要因素，個(gè)體表現(xiàn)為對(duì)氯吡格雷的反應(yīng)性降低或無反應(yīng)[10]。但僅依據(jù)CYP2C19基因型來指導(dǎo)臨床用藥并不一定能達(dá)到較為滿意的治療結(jié)果。

已有相關(guān)研究證實(shí)，血小板P2Y12受體的基因多態(tài)性會(huì)影響冠心病患者的發(fā)病率。目前，由ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率檢測(cè)作為評(píng)價(jià)氯吡格雷療效的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本課題基于前期的研究結(jié)果[11-12]，通過對(duì)298例腦卒中患者檢測(cè)其CYP2C19、P2Y12基因分型，分析患者一般資料和高危因素(高血壓、糖尿病、高血脂等)，從中篩選出CYP2C19*2患者，觀察其P2Y12不同基因位點(diǎn)C34T、G52T、i-T774C在用藥前后血小板聚集率的差值比較，旨在研究CYP2C19、P2Y12基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗之間是否存在相關(guān)性，結(jié)合血小板聚集率檢測(cè)，為個(gè)體化用藥提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2019 年1 月至2020年12 月于貴州航天醫(yī)院住院、臨床診斷為缺血性腦卒中的患者 298 例，其中男210 例，女88 例；年齡40 ～ 85 歲，平均(65.0 ± 9.8)歲。入選患者均排除對(duì)氯吡格雷和阿司匹林過敏或不耐受，符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)≥3分，并在開展研究前簽署知情同意書。

1.2藥品、試劑及設(shè)備 硫酸氯吡格雷片(商品名：波立維，杭州賽諾菲制藥有限公司，每片75 mg)，拜阿司匹林腸溶片(德國(guó)拜耳有限公司，每片100 mg)；ADP(美國(guó)Sigma公司)，血液基因組 DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，人類 CYP2C19 基因檢測(cè)試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司)，C34T、G52T、i-T774C各基因型引物(上海生工生物工程有限公司合成)；7500 型 real time Quantitative-PCR儀(美國(guó)ABI 公司)，普利生 LBY-NJ4 血小板聚集率測(cè)試儀(北京普利生儀器有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1CYP2C19 基因型檢測(cè) PCR 檢測(cè)法：抽取患者服藥前當(dāng)天的空腹靜脈血 2 mL于乙二胺四乙酸( EDTA) 抗凝管中，4 ℃冰箱內(nèi)保存； 采用血液基因組 DNA 提取試劑盒提取入選患者 DNA 樣本，取2 μLDNA溶液，分別在紫外分光光度計(jì)260、280 nm處測(cè)定DNA溶液光密度(OD)值，估算DNA的純度與濃度。所提取的DNAOD260/OD280比值均達(dá)到1.8～2.0，說明DNA濃度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，-20 ℃保存并于24 h 內(nèi)檢測(cè)；取 2 μL DNA 樣本加入分裝好的 CYP2C19 基因檢測(cè) PCR 反應(yīng)管中，按要求上機(jī)檢測(cè)( AB 7500) 。CYP2C19 基因型分為野生型*1/*1，突變雜合型*1/*2、*1/*3、*1/*17，突變純合型*2/*2、 *3/*3、*2/*3、*17/*17。所有患者在治療前先接受基因多態(tài)性檢測(cè)，后首劑給予氯吡格雷負(fù)荷劑量 300 mg每天1次，之后長(zhǎng)期給予氯吡格雷 75 mg 每天1次[13]。本研究中所有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)均在貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室使用相關(guān)科研設(shè)備完成。

1.3.2患者一般資料及高危因素相關(guān)性分析 對(duì)研究中患者的性別、年齡、血糖、血壓、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同代謝表型患者進(jìn)行分組，研究其相關(guān)性。

1.3.3P2Y12基因多態(tài)性檢測(cè) C34T、G52T、i-T774C各基因型參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]，使用Primer3軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和延伸引物并合成。外顯子C34T引物：上游5′-GAAATGCAAGCCGTCGAGAA-3′，下游5′-AGTGTAGAGCAGTGGGAAGA-3′。P2Y12外顯子G52T引物設(shè)計(jì)：上游5′-AAGATGAGAAACCTCAACTTTTAG-3′，下游5′-AACAGGACAGTGTAGAGCAGTG-3′。內(nèi)含子i-T774C引物：上游5′-TTTGGGGAATTTAAGTGCTAC-3′，下游5′-CCACAATAGGCAGCTATAATG-3′。

1.3.4血小板聚集率檢測(cè) 抽取CYP2C19*2 基因型患者發(fā)病當(dāng)天及服藥7 d后血液樣本，以5 μmmol/L ADP為誘導(dǎo)劑，采用光度比濁法(TPA)檢測(cè)血小板聚集率。氯吡格雷反應(yīng)變異性參照ANGIOLILLOD等[15]提出的定義，以血小板聚集率與基線水平差值小于或等于10%作為氯吡格雷抵抗的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)血小板聚集率與基線水平差值(服用氯吡格雷前血小板聚集率-服藥后血小板聚集率)<10%認(rèn)為氯吡格雷無反應(yīng)，10%～<30%為低反應(yīng)，≥30%視為正常反應(yīng)[16]。

2 結(jié) 果

2.1CYP2C19基因型和代謝表型分布情況 入選的腦卒中患者中以CYP2C19*1/*1基因型發(fā)生率最高(39.9%)，CYP2C19*3/*3及CYP2C19*1/*17基因型發(fā)生率最低(均為0.3%)。具體結(jié)果見表1。

表1 CYP2C19 基因型和代謝表型分布情況[n( %),n=298]

2.2不同代謝表型患者基本資料及高危因素分析 4種代謝表型的患者在年齡、性別及合并高血壓、糖尿病、高血脂等高危因素間均未見明顯差異，見表2。

表2 不同代謝表型患者基本資料及高危因素分析[n(%)]

2.3298例患者P2Y12受體基因型分布情況

2.3.1C34T位點(diǎn)組 共成功分型出281例，其中CC型166例，CT型96例，TT型19例，基因型頻率分別為59.1%、34.2%、6.8%，其中C等位基因?yàn)?6.2%，T等位基因?yàn)?3.8%。

2.3.2G52T位點(diǎn)組 共成功分型出267例，其中GG型162例，GT型88例，TT型17例，基因型頻率分別為60.7%、33.0%及6.4%，其中G等位基因?yàn)?7.2%，T等位基因?yàn)?2.9%。

2.3.3i-T744C位點(diǎn)組 共成功分型出277例，其中TT型156例，TC型109例，CC型12例，基因型頻率分別為56.3%、39.4%及4.3%，其中T等位基因?yàn)?6.0%，C等位基因?yàn)?4.0%。采用χ2檢驗(yàn)判斷各等位基因和基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，P>0.05表示病例來自群體符合遺傳平衡，表明樣本具有一定的群體代表性。

2.4155例CYP2C19*2(GA型+AA型)患者P2Y12基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷抵抗的影響分析

2.4.1C34T位點(diǎn)組 共成功分型出147例，其中CC型83例，CT型56例，TT型8例，基因型頻率分別為56.5%、38.1%、5.4%，其中C等位基因?yàn)?5.5%，T等位基因?yàn)?4.5%。測(cè)定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 P2Y12受體C34T位點(diǎn)各基因型分布與血小板聚集率差值比較

2.4.2G52T位點(diǎn)組 共成功分型出145例，其中GG型91例，GT型48例，TT型6例，基因型頻率分別為62.8%、33.1%、4.1%，其中G等位基因?yàn)?9.3%，T等位基因?yàn)?0.7%。測(cè)定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 P2Y12受體G52T位點(diǎn)各基因型分布與血小板聚集率差值比較

2.4.3i-T744C位點(diǎn)組 共成功分型出148例，其中TT型78例，TC型60例，CC型10例，基因型頻率分別為52.7%、40.5%、6.8%，其中T等位基因?yàn)?3.0%，C等位基因?yàn)?7.0%。測(cè)定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 P2Y12受體i-T744C位點(diǎn)各基因型分布與血小板聚集率差值比較

3 討 論

氯吡格雷作為臨床常用的抗血小板聚集藥物，其療效受CYP2C19基因多態(tài)性影響，超過60.6%的中國(guó)患者攜帶 CYP2C19*2、*3等位基因缺失(LOF)，而只有攜帶2個(gè)CYP2C19 LOF(PM)的患者預(yù)后情況不良[17-18]。一項(xiàng)關(guān)于東亞人群的研究中發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2、*3等位基因攜帶者均出現(xiàn)血小板較高聚集性，并可能降低氯吡格雷的治療效果[19]。既往相關(guān)研究顯示，攜帶CYP2C19*2或*3等位基因患者在氯吡格雷治療中不能有效預(yù)防腦卒中的復(fù)發(fā)[20]。本研究共298例腦卒中患者，以CYP2C19*1/*1基因型發(fā)生率最高，CYP2C19*3/*3及CYP2C19*1/*17基因型發(fā)生率最低。根據(jù)代謝表型分為：UM型4例、EM型119例、IM型133例、PM型42例，故遵義市腦卒中患者基因分布情況以EM型和IM型為主。

既往研究關(guān)于 CYP2C19 基因型與年齡、性別、合并糖尿病等基礎(chǔ)疾病之間的相關(guān)性存有爭(zhēng)議[21-22]，本研究中關(guān)于CYP2C19各基因型與患者年齡、性別、合并高血壓、糖尿病、高血脂等高危因素間均未見明顯差異，推斷可能與收集樣本量較小有關(guān)。在后續(xù)的研究中，可通過擴(kuò)大樣本量，納入如民族[23]等因素綜合分析。

迄今為止，關(guān)于P2Y12基因多態(tài)性與腦卒中的研究仍較缺乏， 并且P2Y12受體基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷的療效影響及不良反應(yīng)發(fā)生率仍存在較多爭(zhēng)議，所以，P2Y12受體與心腦血管等疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性成為研究熱點(diǎn)[24-25]。本研究中選取CYP2C19*2患者分析P2Y12基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗之間相關(guān)性[26]，結(jié)果證實(shí)P2Y12受體中C34T、G52T基因位點(diǎn)可能與氯吡格雷抗血小板作用無明顯相關(guān)性,該結(jié)果與既往研究結(jié)果相符[27]。i-T744C位點(diǎn)與血小板活性有相關(guān)性，可能是導(dǎo)致氯吡格雷抵抗的原因之一，該結(jié)果與陳昕朦等[14]研究中缺血性腦卒中患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的結(jié)果相一致。但還需要進(jìn)一步的前沿性試驗(yàn)予以論證，也可作為今后研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。相關(guān)研究表明，攜帶PM基因患者的血小板抑制率

綜上所述，在條件允許的情況下，臨床上對(duì)患者進(jìn)行基因型的檢測(cè)顯得十分必要，以此來克服氯吡格雷在CYP2C19 LOF患者中藥效明顯降低的現(xiàn)象。對(duì)于腦卒中患者可以采用聯(lián)合用藥或使用其他新型抗血小板藥物(如替格瑞洛、普拉格雷、坎格瑞洛、西洛地唑等)，這對(duì)防止患者病情進(jìn)一步加重、改善預(yù)后等方面具有指導(dǎo)意義。另一方面，可通過患者門診復(fù)診、再次入院及電話等方式開展隨訪，收集使用藥物的主要不良反應(yīng)發(fā)生情況。這樣既可以及時(shí)調(diào)整更有效的用藥方案，也有利于降低心腦血管不良事件的發(fā)生率，對(duì)抗血小板治療管理及個(gè)體化用藥均具有非常重要的研究意義。