DNA損傷修復與特發性肺纖維化關系的研究進展*

李永霞 綜述，江 宇 審校

(重慶醫科大學附屬大學城醫院呼吸科，重慶 401331)

特發性肺纖維化(IPF)是一種病因不明的間質性肺疾病，其特征是肺泡上皮細胞及肺成纖維細胞異?；罨鲋?、分泌過多的細胞外基質(ECM)，導致進行性呼吸困難、呼吸衰竭甚至死亡。近年來，IPF發病率呈上升趨勢，目前病因仍不明確，尚無有效的治療及預防措施，且此病預后極差，如不進行干預，確診后的中位生存期僅為2～3年[1]。 因此，明確IPF的發病機制對尋求有效治療靶點顯得十分必要，更是人類對健康的迫切要求。

1 IPF的發病機制

目前，IPF的確切發病機制尚不清楚。最近的研究發現，環境因素、遺傳因素、炎性反應、病毒感染、氧化應激等均在IPF的發病機制中起著重要作用[2-8]。一些流行病學研究表明，環境暴露對IPF的發展起著至關重要的作用。IPF的發病與煙草、二氧化硅、金屬粉塵之間存在顯著相關性[2]。病毒、真菌和細菌等微生物在IPF的發病機制中也發揮了作用。IPF患者與健康人相比，菌群組成較為不平衡[3]。

IPF的發生也與遺傳和基因型有關，研究表明高達1/5的IPF患者其家庭成員也患有肺纖維化。IPF中肺成纖維細胞與凋亡有關的某些凋亡相關基因的啟動子區域高度甲基化有關，低甲基化與p53誘導凋亡的成纖維細胞釋放的應激反應蛋白TP53INP1上調有關[2]。MUC5B也被證明與家族性間質性肺炎和散發性IPF高度相關。還有報道TERT、TERC等位點也與IPF的發生密切相關[2]。作者對IPF表觀遺傳學的認識不斷增加，這可能會發現新的治療方法，比如表觀遺傳學基因調節劑的運用，也許可以有效地預防或延緩肺纖維化的進展。炎性反應被認為是IPF發病的重要組成部分，在整個IPF發生過程中，特別是早期炎癥階段，多種炎癥因子參與其中，如核轉錄因子(NF-κB)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、白細胞介素-8(IL-8)等[4-5]。當機體受到損傷時，巨噬細胞立即產生細胞因子參與炎性反應，隨后募集成纖維細胞、上皮細胞和內皮細胞進行修復，而機體受到持續性損傷時，可能造成肺上皮細胞受損、炎癥細胞浸潤和細胞因子網絡調控失衡，從而導致肺纖維化的發生[5]。

肺組織處于含氧環境，比其他組織更容易受到氧化應激損傷，有研究顯示，氧化、抗氧化機制失衡是IPF發病機制之一[6-7]。高濃度的活性氧會導致肺泡上皮細胞膜相結構脂質雙層的穩定性降低，使DNA單鏈斷裂或破壞，促進含硫蛋白質的交聯，使多肽直接斷裂成片段，導致細胞損傷和壞死。壞死細胞釋放出細胞內的物質，誘導炎性反應并產生更多活性氧進一步損傷鄰近組織，可能引起IPF[8]。而其中涉及的DNA損傷也是可能造成IPF發生、發展的重要因素，但目前相關報道較少。

2 DNA損傷修復與多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)

當細胞受到外源性或內源性因素攻擊時會發生DNA損傷，DNA損傷方式包括DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂。如果DNA單鏈斷裂不能及時修復則可能發展為DNA雙鏈斷裂，且DNA雙鏈斷裂較為嚴重，修復較慢也較困難，可能引發細胞功能障礙甚至細胞死亡[9]。

PARP-1是細胞中最豐富的PARP酶，其產生長而分支的多聚二磷酸腺苷核糖(PAR)，共價連接到參與基因轉錄、DNA損傷修復和細胞凋亡信號傳導的靶蛋白上。PARP-1與其他DNA損傷修復蛋白(PARP-2,PARP-3)不同，其N-末端(NTR)較長(≥500個殘基)，且與DNA親和力較高，因此PRAP-1在DNA損傷修復機制中發揮關鍵作用，其反應快速而有效，被稱為DNA損傷的傳感器。哺乳動物的PARP-1是一種由6個不同結構域組成的酶，不同結構域分別發揮著DNA結合、催化和調節功能[9]。PARP-1鋅指結構域具有識別DNA損傷功能，這對PARP-1的激活至關重要。PARP-1的2個同源鋅指結構域F1和F2識別損傷的DNA，F1是PARP-1激活的核心參與者，F2在PARP-1激活中的確切作用尚不清楚。研究表明，F1和F2與DNA的相互作用相似，但F1和F2對DNA的親和力并不相同，F1的DNA親和力明顯低于F2，但F1對PARP-1的DNA損傷依賴性激活至關重要，而F2對PARP-1的激活可有可無，F2對DNA的高結合親和力表明F2對PARP-1定位和DNA斷裂的維持有重要作用。鋅指結構域F3不直接與DNA結合，但其對PARP-1激活也很重要，其包含介導結構域間接觸的關鍵殘基，并且在DNA損傷依賴性激活時對PARP-1組裝至關重要[9]。PARP-1激活導致PARP-1結構塌陷，其中鋅指結構域F1和F3、WGR結構域和催化(CAT)結構域共同與受損DNA結合。CAT結構域包括2個子結構域：螺旋(HD)結構域和ART結構域。WGR結構域是一個DNA結合結構域，位于CAT結構域附近，與5′-磷酸化位點結合，誘導調節HD結構域的構象變化，參與DNA損傷依賴性激活[10]。

PAR以輔酶I(NAD+)為底物，由PARPs合成，在細胞應激反應中最常見。在DNA損傷時，PARP-1以NAD +作為底物，催化單腺苷核糖或PAR與各種受體蛋白結合，這是響應DNA損傷的最早事件[11]。隨后DNA修復蛋白和核酸酶被招募到損傷部位，進行DNA損傷修復。PRAP-1對DNA單鏈斷裂及DNA雙鏈斷裂均可進行修復，其參與DNA損傷修復的方式有多種，主要包括同源重組、非同源末端結合、錯配修復、堿基切除修復(BER)和核苷酸切除修復[12]。其中最常見的是PARP-1通過BER參與DNA單鏈斷裂修復，當DNA在各種因素作用下(如烷化劑)發生單鏈斷裂，PARP-1能迅速識別這些斷裂，識別并結合在DNA單鏈缺口上，介導支架蛋白XRCC1聚集，在斷裂部位與其他核心因子(如DNA連接酶Ⅲ和DNA聚合酶β等)組裝，以進行DNA損傷修復[13]。PARP-1如何參與DNA雙鏈斷裂的修復目前仍不清楚?，F報道關于PARP-1參與DNA雙鏈斷裂修復的機制有2種：第一種是PARP-1通過參與同源重組修復直接調節DNA雙鏈斷裂修復，第二種是PARP-1通過BER等參與DNA單鏈斷裂修復，間接影響DNA雙鏈斷裂修復[12]。

PARP-1對DNA損傷修復有重要意義，DNA損傷較輕微時，PARP-1激活可促進DNA修復，維持了細胞的完整性，使細胞得以存活。抑制PARP-1的活性可使DNA損傷無法及時得到修復，出現損傷加重甚至DNA雙鏈斷裂等嚴重情況，最終造成染色體不穩導致細胞凋亡或壞死[14]。目前，PARP-1抑制劑已被用于臨床，可以作為化療藥物、免疫治療和放射治療的增強劑[14]。PARP-1抑制劑的靶向治療目前在臨床上也被廣泛運用于治療惡性腫瘤，如乳腺癌和卵巢癌。在小細胞肺癌(SCLC)中，在臨床前模型中，PARP-1抑制劑和基于鉑的化療相結合顯示出優于單獨化療的療效[15]。PARP-1抑制劑的出現改變了醫生對各種惡性腫瘤患者的臨床管理方式，給腫瘤患者帶來了新的治療方案選擇，對改善患者預后及延長生存期有一定幫助，但PARP-1抑制劑這些藥物的長期毒性還需要進一步深入研究。

3 PARP-1與NF-κB

免疫反應和炎性反應的調節是一個復雜的生理過程，對維持生物體的內環境穩定有重要意義。沒有免疫反應和炎性反應，機體就無法在充滿病原體的世界中生存。炎性反應由一系列復雜的炎癥介質參與，各種炎癥因子緊密協調才能維持機體適當和及時的反應，不會出現可能對宿主造成損害的過度反應。如果長期存在不適當或過度免疫反應和炎性反應，機體將因這些生理反應造成損害，甚至死亡。因此，促炎和抗炎機制必須維持平衡，人體才能在引發免疫和炎性反應的環境刺激下生存。人體內有許多機制來調節炎性反應。NF-κB長期以來一直被視為炎性反應過程中的中心介質。NF-κB對免疫和炎性反應中涉及的多種基因表達的調節起著關鍵作用，包括細胞因子、細胞黏附分子、補體因子和多種免疫受體[16-17]。

目前，研究最多形式的NF-κB是由2個亞基p50(NF-κB1)和p65(RelA)組成的異二聚體。細胞未受到刺激時，NF-κB與細胞質中的κB蛋白抑制劑(IκB)結合處于未激活狀態，當細胞受到細胞因子[如IL-1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、脂多糖等]、紫外線、氧化劑等刺激，絲氨酸/蘇氨酸激酶誘導IκB磷酸化，隨后發生降解，IκB降解后會釋放NF-κB二聚體并暴露p50和p65的核定位序列，導致NF-κB移位進入細胞核，與染色質中特定κB共有序列結合，并激活特定的基因亞群，從而啟動靶基因的轉錄。NF-κB的激活可誘導趨化因子(MCP-1)、細胞因子(TNF-α、IL-6)和基質金屬蛋白酶(MMPs)的轉錄，介導炎性反應和纖維化的發生[17-18]。

許多報道表明，PARP-1在NF-κB介導的炎性反應中有重要作用。PARP-1可調節NF-κB等炎癥信號轉導途徑，調節和增強NF-κB轉錄活性，進一步促進TNF-α、IL-1β和IL-6等多種炎癥因子的表達，NF-κB途徑是PARP-1調節炎癥的中心途徑[19-20]。PARP-1基因敲除動物或PARP-1抑制劑已被證明可減少炎性反應[21]。有報道表明在急性髓系白血病患者治療中，PARP-1抑制劑奧拉帕尼可以減弱NF-κB途徑的活性，并降低蒽環類抗腫瘤藥物誘導的DNA損傷反應[22]。近年來，PARP-1也被報道是特異性NF-κB依賴性基因激活所必需的，在體內可作為NF-κB的共激活劑，PARP-1通過不同的結構域與NF-κB的2個亞基(p65和p50)相互作用，并在體內與p50和p65一起形成穩定的免疫可沉淀核復合物，從而在炎性反應中發揮作用[23]。還有一些研究表明，持續的DNA損傷可導致PARP-1過度激活，導致細胞NAD+的耗竭，而NAD+再合成會導致細胞三磷酸腺苷儲備耗盡，使能量代謝受損，細胞和線粒體功能障礙，最終導致細胞壞死。其中DNA損傷導致的PARP-1過度激活可以產生炎癥反饋環，PARP-1通過調節NF-κB的表達促進NF-κB介導的炎性反應，NF-κB通路的激活提高誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的水平，從而增加體內一氧化氮(NO)的生成，導致嚴重的氧化應激。氧化應激增加時產生的自由基過氧化產物，導致細胞膜破壞，最終可能導致細胞死亡[24]。

4 NF-κB、TGF-β1與IPF

TGF-β是一種多功能細胞因子，參與多種生物學過程，調節各種細胞的增殖、分化、凋亡、黏附和遷移，如巨噬細胞、活化的T細胞和B細胞、未成熟的造血細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。TGF-β由TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3異構體組成，盡管3種TGF-β亞型結構相似，但它們介導不同的生物學反應。因其細胞組織特異性表達，它們分別與特定的分子和受體的特異性結合發揮作用。除了生理效應外，TGF-β已被證明在免疫調節疾病的發病機制中起重要作用。TGF-β1是一種抗炎因子，對正常發育、組織修復和維持器官功能至關重要，在組織損傷時TGF-β1會發生上調[25]。TGF-β1的上調發生在許多炎癥性肺疾病中，例如慢性阻塞性肺疾病、哮喘和IPF。多種促炎細胞因子可在轉錄水平上調節TGF-β1的表達(如IL-1β、TNF-α等)，TGF-β1作為NF-κB的下游因子，活化的 NF-κB可增加 TGF-β1的表達。TGF-β1啟動子上存在AP-1和NF-κB結合位點，在IL-1β的刺激下，p65 NF-κB和c-jun AP-1被招募到TGF-β1啟動子的特定結合位點(κB3位點)，隨后組蛋白H4和H3在TGF-β1啟動子的不同區域高度乙?；?，最后導致TGF-β1活化參與炎性反應和纖維化的發生、發展[26]。

研究表明，TGF-β1在肺纖維化發生、發展過程中起到十分重要的作用。在多種因素導致的肺纖維化中(包括博來霉素、環磷酰胺和射線)均發現TGF-β1含量增高，并且目前認為TGF-β1是肺纖維化發生、發展的中心環節。其在肺纖維化中的主要作用：趨化并促進成纖維細胞；刺激成纖維細胞合成大量合成膠原蛋白；趨化炎性細胞及單核巨噬細胞，合成釋放細胞因子；誘導肺泡上皮細胞過度增殖和上皮間質轉化(EMT)，從而導致ECM調控失衡ECM沉積。TGF-β信號傳導可分為Smad依賴性途徑和非Smad依賴性途徑。TGF-β1的促纖維化作用主要是通過Smads途徑來完成的[27]。

TGF-β通過與受體復合物結合啟動細胞內信號傳導，受體復合物包含2種跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶，稱為轉化生長因子-β受體Ⅰ型(TGFβRⅠ)和轉化生長因子-β受體Ⅱ型(TGFβRⅡ)。TGFβRⅡ是一種組成性活性激酶，而TGFβRⅠ激酶需要被TGFβRⅡ激酶激活。在大多數細胞類型中，TGF-β直接與TGF-βRⅡ結合。TGFβRⅡ結合的TGF-β隨后被TGFβRⅠ識別，后者被招募到復合物中，并被TGFβRⅡ磷酸化。目前已知的有三類Smads，包括受體調節型Smads(R-Smads)、共同介導型Smads(CoSmads)和抑制型Smads(I-Smads)。Smad1、Smad3、Smad5和Smad8屬于R-Smads，它們可以通過磷酸化TGFβRⅠ直接被激活，與Smad4形成異源低聚復合物。Smad6和Smad7屬于I-Smads，它們可通過與TGF-βRⅠ相互作用來調節R-Smads的活性，主要阻止R-Smads磷酸化并通過泛素蛋白酶降解途徑將其降解[27]。TGF-β1信號轉導分兩步：即TGF-β1與其受體結合及受體的活化和Smads蛋白的激活。在細胞外，大多數TGF-β1處于潛在的形式，或者以潛伏相關肽(LAP)的形式保持失活狀態?；罨骉GF-β1從LAP上釋放，以同源二聚體形式與TGF-βRⅡ結合，同時與Ⅰ型受體結合導致受體異質二聚體的激活，啟動下游信號通路?；罨腡GF-βRⅠ使Smad2和Smad3分子磷酸化，Smad2、Smad3與Smad4分子結合，形成Smad復合物轉移至核內，與各種轉錄因子相互作用調控相關基因的轉錄。最終導致目標基因的激活，參與細胞分化、增殖、遷移、EMT等，而Smad7對TGF-β信號轉導途徑均起抑制作用，因此有人認為Smad7的上調可能是潛在TGF-β1保護細胞免受炎癥侵襲和纖維化的重要機制[27-28]。Smad還可與包括NF-κB在內的其他細胞因子相互作用，以調節炎癥和纖維化的發生、發展。

目前認為持續慢性炎癥反應是肺纖維化發展的驅動力，因為其啟動了纖維化階段。NF-κB在炎癥中起著非常重要的作用，參與炎性反應的中心環節，通過調節其靶炎癥細胞因子、黏附分子和促炎酶促進肺組織的纖維化。活化的NF-κB還可以通過提高其下游TGF-β1的水平，進一步促進肺纖維化的發生。因此，NF-κB信號通路通過炎性反應參與了IPF的病理生理過程。

總之，TGF-β/Smad信號和NF-κB途徑是介導IPF發生、發展的重要途徑。

5 小 結

越來越多的證據顯示，DNA損傷及修復可能導致IPF的發生、發展，當發生DNA損傷時，PARP-1立即識別并與缺口處結合，募集多種細胞因子進行修復，同時也會發生炎性反應，NF-κB作為PARP-1的共激活因子也參與其中，并且NF-κB可通過激活下游分子TGF-β1進一步促進纖維化的發生。目前，IPF還沒有有效的治療方法，在理論上，作用于上述細胞因子及其信號通路的藥物聯合應用可能為IPF提供了新的治療途徑和機會。因此，建立與臨床病程相匹配的肺纖維化動物模型是進一步尋找潛在治療藥物的關鍵環節。