生物合成α-半乳糖苷酶的研究進展

陳 可，劉 星，張景韻，蔡志強

（常州大學 藥學院，江蘇 常州 213164）

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，EC.3.2.1.22）屬于外切糖苷酶類，具有較強的水解能力，可以催化水解糖蛋白、糖脂、半乳甘露聚糖和半乳糖脂的末端α-半乳糖基[1]，也可以切割棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖等棉子糖家族寡糖（raffinose family oligosaccharides，RFOs）在半乳糖和葡萄糖之間的α-1,6糖苷鍵。此外α-半乳糖苷酶廣泛存在于自然界中，其作為生物催化工具[2]，在食品、飼料、益生元、生物煉制、紙漿加工、制糖工業以及生物醫藥學等不同行業中都能發揮作用。該酶的水解特性可以降解豆類植物中的α-低聚半乳糖（α-galactooligosaccharides，GOS），消除飼料中的抗營養因子（α-半乳糖苷類物質），避免人或動物在攝食后胃腸脹氣的發生[3]；也可以作為外源酶添加到飼料中，消除棉子糖家族寡糖，提高飼料的利用率[4]；此外該酶在治療法布里病時也起著重要作用[5-6]，使用酶替代療法（enzyme replacement therapy，ERT）彌補患者本身缺乏的溶酶體α-半乳糖苷酶，現已研究出一款治療法布里病的藥物Fabrazymeagalsidase-β，并于2003年上市，該藥也是美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準的唯一一種治療法布里病的藥物。

目前微生物源的α-半乳糖苷酶因其在生產過程中較好的耐受能力和在廉價底物上能快速生長使其在經濟上更適合于工業開發[7]，但由于天然的α-半乳糖苷酶經發酵后活性依舊較低，需要依靠某些誘變等方法來提高酶活活性，這不僅增加了該酶的生產成本且使對α-半乳糖苷酶的研究局限于實驗室小試。而隨著技術的不斷發展，國內外研究者正著力于探索新的α-半乳糖苷酶基因并克隆和表達到合適的宿主中，以提高酶的催化效率、產量和耐受性，從而達到產業化生產這一終極目標，同時對于該酶的高效分離純化方法也有待進一步的研究。因此，本文綜述了近年來α-半乳糖苷酶的發酵生產工藝、異源表達和分離純化等研究內容，并展望了其今后的發展，對α-半乳糖苷酶商業化和產業化的研究也具有一定意義。

1 α-半乳糖苷酶催化機制

糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）是由一個能夠催化糖苷鍵分解的大家族酶組成，根據氨基酸序列相似性，在CAZy數據庫中將報道的α-半乳糖苷酶分為糖苷水解酶家族GH-4、GH-27、GH-31、GH-36、GH-57、GH-97和GH-110，現有研究發現，大部分的α-半乳糖苷酶屬于GH-27和GH-36家族，而在GH-4和GH-36家族中主要由原核起源的酶組成，GH-27家族包含原核和真核起源的酶[8]。若根據酶活性的最佳pH來說，又有酸性酶、堿性酶之分，大多數酸性α-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶GH-27家族，而在GH-36家族中既有酸性酶，又有堿性酶和中性酶。

在催化糖苷鍵分解時，根據糖苷水解酶催化底物分子異頭碳構型是否發生轉變，可分為兩種不同的催化水解反應機制：保持機制和反轉機制。GH-4、GH-27、GH-36和GH-57家族的α-半乳糖苷酶遵循保留機制；GH-110家族的α-半乳糖苷酶遵循反轉機制；而GH-97家族的α-半乳糖苷酶是一個值得注意的例外，同時擁有保留和反轉機制。這兩種催化機制中，遵循反轉機制的水解反應通常是由一步法實現，涉及類似碳鎓離子的過渡態，該催化反應由兩個氨基酸側鏈的廣義酸/堿催化劑協助發生，通常是谷氨酸和天冬氨酸，由糖苷鍵上的氧攻擊酸催化劑上的氫；同時在堿催化劑的作用下水分子攻擊底物的異頭碳，使糖基解離出來，這種催化方式使水解產物的構型發生了轉變。保留機制的水解反應是一個兩步反應，其中每步反應也都涉及類似碳鎓離子的過渡態，由兩個氨基酸側鏈的廣義酸和廣義堿協助發生通常是谷氨酸和天冬氨酸，該反應采用雙置換機制，經過糖基化和去糖基化這兩步使水解產物的構型保持不變，即在第一步糖基化反應中，一個殘基作為親核試劑，對底物的異頭碳進行親核攻擊，促進糖-酶中間體的合成，與此同時，另一個殘基起酸催化的作用，在糖苷鍵斷裂時使其質子化，第二步是去糖基化反應，在水分子水解糖-酶中間體時，另一個殘基起堿催化的作用，在水分子攻擊時使其去質子。而GH-4家族的α-半乳糖苷酶的水解反應在遵循保留機制時，區別于其他家族的是需依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）輔助因子催化，通過陰離子過渡態進行消除和氧化還原。保持機制和反轉機制見圖1、圖2。

圖1 糖苷水解酶家族反轉機制（GH-4、GH-27、GH-31、GH-36、GH-57和GH-97）Fig.1 Inversion mechanism of glycoside hydrolase family (GH-4、GH-27、GH-31、GH-36、GH-57 and GH-97)

圖2 糖苷水解酶家族保持機制（GH-97和GH-110）Fig.2 Retention mechanism of glycoside hydrolase family (GH-97 and GH-110)

2 微生物源的α-半乳糖苷酶

α-半乳糖苷酶廣泛存在于大自然中，早期COURTOIS J E等[9]在咖啡豆中發現了該酶，之后在多種植物以及哺乳動物中均發現了該酶，而在微生物中更是表現出了α-半乳糖苷酶的巨大生產潛力，尤其是微生物易于培養，胞外分泌，不僅能在廉價的農業副產物上生長，而且對于不同的溫度和酸堿度范圍內有較強的穩定性，這些特性使得α-半乳糖苷酶在食品及飼料加工上有顯著作用。已有研究發現，嗜熱微生物是嗜熱和耐熱酶的主要微生物來源，JANG J M等[10]從Irpexlacteus克隆出一種具有高催化效率、熱穩定性和pH穩定性的α-半乳糖苷酶，屬GH-27家族，該酶在70 ℃和pH4.8時活性最大，在pH3～11內保持活性穩定，且在50 ℃和60 ℃培養10 h后依舊保留了90%以上的活性，表現出獨特的耐熱性和pH穩定性，同時也發現其對RFOs具有非常高的催化效率。XIE J等[11]從總狀橫梗霉（Lichtheimia ramosa）中發現并成功表達了一個屬GH-36家族的新的α-半乳糖苷酶基因，該重組酶在65 ℃和pH6時活性最大，在pH4.5～6.5內仍能保留大部分活性，在60 ℃或更低溫度條件下均能保持穩定，該酶與GH-36家族的其他α-半乳糖苷酶不同的是，除了能消除RFOs外還對半乳甘露聚糖有水解作用。這些具有熱穩定性質的酶將有助于食品和飼料的加工。

目前也有更多不同地方微生物來源的α-半乳糖苷酶被發現和鑒別出來，據報道產α-半乳糖苷酶的微生物主要包括細菌、真菌、放線菌等，ZHOU J等[12-13]從云南的磷酸鹽堆放地的礦渣和鹽漬土中發現了一株新的菌株中生根瘤菌（Mesorhizobiumsp.）JB07，并從中分離出了兩種屬于GH-36的α-半乳糖苷酶AgaAJB07和AgaAHJG4，之后又在該地的鹽礦中發現了產自菌株海洋桿菌屬（Pontibactersp.）HJ8中一種新型的屬于GH-27家族的α-半乳糖苷酶。此外真菌來源的該酶多被曲霉屬、青霉屬等廣泛研究，WANG H等[14]從來自某錫礦酸性廢水中分離出一種新型的嗜熱真菌費希新薩托菌（Neosartorya fischeri）P1，能分泌出高活性的胞外α-半乳糖苷酶；劉德海等[15]首次從紫花苜蓿草種植土壤中分離出一株產α-半乳糖苷酶的黑曲霉菌株A1-19。而在益生菌[16]的研究中也能發現α-半乳糖苷酶，如雙歧桿菌、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）以及乳酸桿菌，其抗菌活性、在刺激的腸胃環境中的存活率、儲存期間的存活率較高而言，因此是理想的候選來源。對于從不同環境中分離鑒別出的α-半乳糖苷酶在經研究后發現了該酶具有更多不同的優良特性，這也使得它們在功能上存在差異性，近年來國內外關于微生物源的α-半乳糖苷酶的研究概況見表1。

表1 微生物源的α-半乳糖苷酶的研究概況Table 1 Overview of α-galactosidase from microorganisms

3 產α-半乳糖苷酶菌株的發酵工藝研究

3.1 固態發酵

固態發酵（solid state fermentation，SSF）可以定義為在沒有或幾乎不存在游離液體的情況下，微生物在潮濕、水不溶性的固體基質上生長的技術[24]。固體基質是一種復雜的大分子混合物，通常是在農業和工業活動時產生的殘留物，視為農工副產品[7]，如麥麩、米糠、甘蔗渣、水果和蔬菜加工廢料等。因此有必要找到并采用一種適當的無害環境、低成本和經濟上可行的方法來處理這些農工副產品，所以利用農工業殘留物作為生產α-半乳糖苷酶的固體基質不僅增加了它們自身的價值，而且為處理日益構成威脅的農工廢物提供了一種獨特的解決辦法。

KOTWAL S M等[25]研究發現了一種嗜熱真菌腐質霉，能在固態發酵中利用各種農業殘留物生產胞外α-半乳糖苷酶，當用大豆粉作為碳源時，其酶活性最大。此外通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）研究發現，該真菌菌絲體纏繞在固體基質上，具有很高的生長密度，致使真菌分泌出大量的α-半乳糖苷酶。SAAD R R等[26]研究發現了一株耐高溫真菌能利用不同豆科植物的種子和外殼作為固體基質發酵產酶，研究表明，鷹嘴豆種子是該酶最佳的固體發酵基質。SHANKAR S K等[27]利用紅豆植物廢料和麥麩為復合固體基質對真菌米曲霉進行固態發酵，將麥麩與紅豆植物廢料以1∶2（g∶mL）混合，在最適條件下發酵所產α-半乳糖苷酶的酶活性最高。綜上，可以利用農副產品作為固體基質進行固態發酵，且在發酵時呈現的蓬松狀態有利于真菌菌絲附著在其表面生長從而更便于產生大量的酶。

此外，由于農業副產物容易獲得且價格低廉，在大規模產酶時發揮了極大的成本優勢。如ANISHA G S等[28]利用大豆粉為固體基質對灰鏈霉菌產胞外α-半乳糖苷酶的研究，使用填充床生物反應器在SSF中生產絲狀菌的α-半乳糖苷酶，發現此時該酶的產量比在錐形瓶中發酵提高了約100%。而VIDAY C H等[29]首先篩選出了15株真菌，檢測發現泡盛曲霉（Aspergillus awamori）MTCC 548中的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性最高，之后在該菌株發酵時用脫脂大豆粉代替了麥麩，并將小試工藝放大，在不銹鋼托盤對該產酶菌株進行大規模的固態發酵。由此可見，在固態發酵時可利用農工副產品作固體基質發酵產α-半乳糖苷酶，不僅具有成本效益，也為指導α-半乳糖苷酶的大規模生產展示了巨大潛力。

3.2 液態發酵

液態發酵（submerged fermentation，SMF）是一種將微生物作為懸浮培養物進行培養，并將其產物釋放到發酵液中的發酵生產方式。SANADA C T N等[30]利用大豆蜜糖酒精發酵的殘渣大豆酒槽為底物進行液態深層發酵產α-半乳糖苷酶，通過篩選發現敏捷乳桿菌（Lactobacillus agilis）LPB 56的酶活性較高，該菌株在發酵144 h后，酶活性達到最高，為11.07 U/mL。ALVAREZ-CAO M E等[31]利用廉價的農副產品蜜糖作為生產α-半乳糖苷酶的底物，降低了酶的生產成本有助于循環經濟。與固態發酵相類似，液態發酵也能以廉價的農作物為底物，且獲得的發酵液能直接作為酶混合物應用到某些工業中去，這些都為利用農業殘渣創造更高價值的工業發展顯示了廣闊前景。此外，在發酵工藝中不同固體基質對α-半乳糖苷酶的活性也有不同的影響，對近年來微生物發酵所產α-半乳糖苷酶活性的研究概況見表2。

表2 α-半乳糖苷酶的發酵工藝Table 2 Fermentation technology of α-galactosidase

3.3 發酵工藝的優化

在固態或液態發酵產α-半乳糖苷酶時，篩選合適的固體基質、碳源、氮源等因素，以及確定合適的發酵條件都對酶的活性和產量有一定的影響，因此需要采用單因素、正交試驗以及響應面法等方法進行工藝優化，以發掘產α-半乳糖苷酶菌株的最大潛力。

在微生物發酵時，碳源和氮源是為生物合成、產物形成和代謝提供能量的基本營養物質。GURKOK S等[39]通過響應面優化法研究發現，在煙曲霉發酵時，采用甘蔗糖蜜和NH4NO3分別為碳源、氮源，使α-半乳糖苷酶的產量增加了4倍。GAJDHANE S B等[34]通過Plackett Burman試驗設計關鍵的培養基成分，在以麩皮為底物的前提下，確定了補充碳源和氮源分別為甘蔗糖蜜和豆粕，然后采用響應面優化法確定其最佳濃度，使α-半乳糖苷酶的活性提高至218.54 U/g。DONG M等[40]在研究α-半乳糖苷酶的最適條件時，發現當以蔗糖為碳源，（NH4）2SO4/尿素按2∶1比例為復合氮源時，可以提高酶的活性，通過對發酵罐繼續補料研究對其活性影響時發現，在不斷添加半乳糖時，其既能作為誘導物也能作為底物補充損失掉的營養，從而可以使α-半乳糖苷酶的活性達到最高。

此外，除基本的碳源氮源等營養因素，某些金屬離子如Fe2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+等也是微生物在發酵過程中不可或缺的微量元素，其中部分金屬離子對酶的活性起促進作用，相反也會抑制酶的活性。DELGADO-FERNANDEZ P等[16]在研究金屬離子對植物乳桿菌產α-半乳糖苷酶活性的影響時發現，在培養基中添加Mn2+和Fe2+時能使α-半乳糖苷酶的活性提高145%和139%，相比之下添加Hg2+和Cu2+時都分別抑制了α-半乳糖苷酶的產生。YE F等[41]研究發現，金屬離子濃度的不同對α-半乳糖苷酶的活性也有不同的影響，在濃度相同的情況下，K+、Ba2+、Pb2+、Hg+、Al3+和Cr3+相比于Ca2+、Mg2+、Cd2+對α-半乳糖苷酶有明顯的抑制作用，而當這些金屬離子的濃度降低時，Ba2+、Pb2+、Al3+和Cr3+又能使α-半乳糖苷酶的活性增加，此外Cu2+和Fe2+對該酶活性具有雙向的影響，當這兩種金屬離子的濃度增加時，其對α-半乳糖苷酶的活性也增加，反之則會抑制其活性的增加。研究表明，金屬離子可以通過影響酶的結構從而改變對酶活性的影響，不同的金屬離子對酶活性的影響也不同。

當微生物進行發酵時，控制微生物的發酵條件（尤其是溫度和pH）也對α-半乳糖苷酶的活性有著至關重要的影響，其活性將在最適的生長環境下達到最大，而稍微偏離最佳條件便會改變微生物的生長和酶的產生。LI Q等[42]研究發現，黑曲霉生產α-半乳糖苷酶會受pH和溫度的影響，當溫度為25 ℃，pH6～7時酶產量較高，是原始的2.2～2.3倍。VIDAY C H等[29]研究了高產α-半乳糖苷酶的曲霉泡盛曲霉（Aspergillus awamori）MTCC 548的小試工藝試驗，并對其發酵條件進行優化，確定了最佳反應條件為溫度28 ℃，pH5.0和發酵120 h，之后將其擴大到容量約3 kg的不銹鋼托盤中進行大規模發酵，最終檢測發現α-半乳糖苷酶活性可達109.27 U/g，這為工業生產α-半乳糖苷酶提供了方向。

4 α-半乳糖苷酶的異源表達

目前，從自然界中篩選得到產α-半乳糖苷酶的菌株很多，但原始菌株在發酵后的酶產量相對較低，有的需要依靠物理或化學誘變等方法來提高酶產量，這也會使大規模生產α-半乳糖苷酶的成本增高，所以獲得高表達、活性高的α-半乳糖苷酶基因并成功表達的方法受到了研究者們的青睞。國內外研究者對分泌表達α-半乳糖苷酶的工程微生物菌株作了一定的研究，從而提高酶的產量，以期望滿足α-半乳糖苷酶的工業化生產。對于不同來源的α-半乳糖苷酶基因編碼的蛋白質也具有不同的酶學性質，經研究發現已經有數個α-半乳糖苷酶基因被克隆并在不同的表達系統中成功表達。基因工程表達系統主要有大腸桿菌，酵母，枯草芽孢桿菌和昆蟲等，其中α-半乳糖苷酶基因主要的表達系統是大腸桿菌和酵母表達系統。

4.1 大腸桿菌表達系統

在各種表達系統中，最早被采用進行研究的是大腸桿菌表達系統，是原核蛋白表達系統的最佳代表。HUANG Y等[43]從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）中克隆了α-半乳糖苷酶基因（AgaB），并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中成功表達，該重組酶在最適條件下比活性高達362.6 U/mg。其天然結構被研究確定為一種同源三聚體，同時它也被發現具有良好的蛋白酶抗性和半乳糖耐受性，且對棉子糖和水蘇糖具有良好的降解活性，利用這些優良性質該重組酶將在食品和飼料行業中去除棉子糖家族寡糖（RFOs）的方面上發揮很大的潛力。FEI Y等[18]在解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus）L6基因組中發現了α-半乳糖苷酶的編碼基因（AglB），對其與乳酸桿菌的其他α-半乳糖苷酶進行氨基酸序列比對，發現其屬于GH36家族，具有保留水解機制。根據L6的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列設計引物，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增得到AglB基因，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達并探究了AglB的最適反應條件。經后續研究發現，該重組酶具有轉糖基化活性可用于低聚半乳糖（GOS）的生產，在最佳反應條件下，以300 mmol/L的蜜二糖為底物可使GOS的最大產量達31.56%。LEE C M等[44]通過構建宏基因組fosmid文庫，在羧甲基纖維素板上對文庫進行功能性篩選，經序列分析發現了一個新的α-半乳糖苷酶基因（Agas2），并在大腸桿菌中成功表達。該重組酶具有良好的pH穩定性，在40 ℃和pH 7.0時表現出最大酶活性高達128.37U/mg。此外，有研究發現在真核生物中克隆出編碼基因表達到大腸桿菌中后，對重組酶菌株進行發酵后所制備得到的粗酶液的活性和比活性都相對較低，如CAO Y等[45]從赤霉素（Gibberellasp.）F75中克隆了α-半乳糖苷酶的基因（aga-F75）并在大腸桿菌中成功表達，研究發現其屬于GH36家族，具有良好的水解能力和熱穩定性，但該酶的活性相對較低，粗酶活性僅為1.42 U/mL。這是由于大腸桿菌缺乏對真核蛋白質的修飾加工系統，細胞周質含有多種內毒素等缺點不利于進行真核生物源蛋白的表達。

4.2 酵母表達系統

酵母表達系統作為一種后起的外源蛋白表達系統，由于兼具原核以及真核表達系統的優點，其生產的酶活性、產量均比較高以及易誘導使其在基因工程領域中倍受青睞。真菌來源的α-半乳糖苷酶具有良好的穩定性且含有信號肽能進行胞外分泌，使酵母表達系統成為該酶研究的熱點，因此產生α-半乳糖苷酶的真菌也受到越來越廣泛的關注，目前利用畢赤酵母來生產α-半乳糖苷酶的研究較多。MI S等[46]在青霉菌（Penicilliumsp.）F63 CGMCC 1669中發現了一種胞外α-半乳糖苷酶，命名為Agl1，根據純化蛋白的部分氨基酸序列，克隆并測序了編碼α-半乳糖苷酶Agl1的基因，成功在畢赤酵母（Pichia pastoris）細胞外表達，并在發酵罐中達到111 U/mL的高產量。該重組的α-半乳糖苷酶的最適pH和溫度分別為5.0和40 ℃，這與單胃動物腸道的物理化學條件基本一致，從飼料添加劑的實際應用來看，該重組α-半乳糖苷酶在飼料中的應用是非常有利的。CHEN Z等[47]克隆了來自太瑞斯梭孢殼霉（Thielavia terrestris）中一種新的α-半乳糖苷酶基因（TtGal27A）并在畢赤酵母中成功表達，研究發現TtGal27A屬于GH27家族，在5 L發酵罐中進行高密度發酵后其酶活性高達4 402 U/mL。此外該酶可以水解棉子糖家族寡糖以及不同的半乳甘露聚糖且表現出良好的蛋白酶抗性，這使得它有潛力應用到食品和飼料工業中去。WANG C等[21]從萊色籃狀菌（Talaromyces leycettanus）JCM12802中發現了一種新型的α-半乳糖苷酶基因，屬于GH27家族，并成功在畢赤酵母GS115中表達。研究發現該重組酶具有良好的嗜熱性，能在70 ℃時表現出最大活性，具有穩定的水解能力以及對半乳糖有良好的耐受性。

類似地，除大腸桿菌和畢赤酵母表達系統以外，也能在其他生物源系統中表達。GüRK?K S等[48]編碼煙曲霉IMI 385708中的α-半乳糖苷酶基因（AglB），克隆到pAN52-4真菌表達載體上，并在3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的控制下在大豆曲霉ATCC11906中成功表達，且不需要添加誘導物，可在重組大豆曲霉菌株中得到2.45U/mL的α-半乳糖苷酶產量，約為初始煙曲霉（0.85 U/mL）的3倍。近年來，研究發現利用基因工程技術可提高α-半乳糖苷酶的水解能力、耐受性和產量，該方法已經成為設計全新分子或修飾天然分子的重要工具，許多α-半乳糖苷酶產生菌株已經成功地通過修飾其氨基酸序列而被改造以增強表達和水解功能，以期望能在工業中發揮它們的最大潛力。

5 α-半乳糖苷酶的分離純化

酶的分離純化是指以熟練、經濟的方式獲得一定純度的酶。胞內酶可通過細胞破碎方法得到粗酶液，胞外酶可經過發酵，通過離心或浸提等方法獲得。在微生物發酵后尤其是固態發酵后粗酶液中的成分復雜，摻雜著其他代謝物或酶類，對此需采取高效的分離純化方法以得到高純度的α-半乳糖苷酶。一般可采用硫酸銨分級沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜等不同層析技術對該酶進行分離純化，而聚丙烯酰胺凝膠電泳法可用于蛋白質分子質量的測定和純度水平的估量。目前α-半乳糖苷酶已從許多來源進行分離純化。MUTRA R等[49]從發芽的綠豆種子中發現了α-半乳糖苷酶，并通過離子交換、凝膠過濾和親和層析柱純化出了低分子量的α-半乳糖苷酶，該酶的純化倍數達522倍，其比活性為146.3 U/mg。SAKHARAYAPATNA RANGANATHA K等[50]從番荔枝種子中發現了一種低分子質量的酸性α-半乳糖苷酶，通過硫酸銨分級沉淀，收集活性高（20%～40%和40%～60%）的部分再采用疏水層析和凝膠過濾層析從種子粗提物中純化α-半乳糖苷酶。純化后的α-半乳糖苷酶在非變性聚丙烯凝膠電泳中顯示分子質量約67 kDa的單一條帶。YE F等[41]在食用菌猴頭菇中發現了一種分子質量為57 kDa的α-半乳糖苷酶，命名為HEG，該酶屬于GH27家族。研究人員分別使用三種離子交換色譜弱陰離子交換層析（DEAE-Sepharose）、弱陽離子交換層析（CM-Sepharose）、強陰離子交換層析（Q-Sepharose）和凝膠過濾層析對猴頭菇粗酶液進行純化直至均一，純化倍數高于大多數α-半乳糖苷酶，高達1 251.64倍，純化后的HEG比活性為46.74 U/mg。VIDYA C H等[29]在泡盛曲霉（Aspergillus awamori）MTCC 548中發現了α-半乳糖苷酶，通過硫酸銨（飽和度50%～80%）沉淀、離子交換和疏水層析使粗提取物中的酶純化至均一，并在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）中觀察到一條單一條帶，該純酶的表觀分子質量約為（118±2）kDa。WANG J等[51]對從米曲霉中克隆的α-半乳糖苷酶（galC）純化，采用鎳離子金屬鰲合親和層析，用咪唑緩沖液洗脫目標蛋白，收集活性高的洗脫液，在SDS-PAGE中觀察到單一條帶分子質量為100 kDa，該重組酶的純化倍數為1.96，比活性為150.9 U/mg，其活性高于一般α-半乳糖苷酶，具有良好的大規模純化潛力。目前已有研究者們發現了更多不同來源的α-半乳糖苷酶，并通過各種層析柱分離純化出來，現對近年來研究的α-半乳糖苷酶的分離純化進行了總結概括見表3。

表3 α-半乳糖苷酶的分離純化Table 3 Isolation and purification of α-galactosidase

6 展望

α-半乳糖苷酶在大自然中無處不在，它的一些優良特性如熱穩定性、pH穩定性、對蛋白酶的抗性等也被研究出來并在各個領域發揮著重要的作用，因此它的市場需求也在不斷的增長，在目前的研究中發現該酶的活性和產量較低不能滿足工業的大規模應用，因此獲得高活性、高產量、低成本的α-半乳糖苷酶是目前研究亟待解決的問題。為了經濟高效地生產α-半乳糖苷酶，可以從以下幾個方面考慮。

①目前對各個家族成員的研究仍有未知存在，對這些酶的催化機制和底物特異性的全面研究將為進一步促進工業應用的研究提供理論基礎。

②雖然生產的成本問題可以通過利用廉價的農業副產物來降低，但對使用固態發酵以提高其產量仍需進一步研究，可以通過對固態發酵和液態發酵中培養的產α-半乳糖苷酶微生物的代謝差異進行研究，以指導該酶的大規模生產。

③隨著基因組測序和宏基因組學的出現，有可能在不局限于可培養物種的情況下探索出不同環境中潛在微生物的基因組庫，以開發更多有特異性的新型工程菌，從而將該酶的某些優良性能應用到各個領域。

④深入研究α-半乳糖苷酶的分離純化工藝，以提高該酶的純度和產量，促進其工業化大規模應用。