黑樹(shù)莓泡制酒的泡制工藝條件優(yōu)化及抗痛風(fēng)功效評(píng)價(jià)

張澤坤，楊 濤，易 沖，王一凡，賴慧寧，陳雨涔，羅紅宇

（1.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.煙臺(tái)市海洋研究院，山東 煙臺(tái) 264003）

痛風(fēng)已成為我國(guó)高發(fā)的代謝性疾病，除遺傳外，飲食不當(dāng)和不良生活方式是痛風(fēng)高發(fā)的主要原因[1]。痛風(fēng)是由體內(nèi)嘌呤代謝紊亂及（或）尿酸排泄減少導(dǎo)致的尿酸鈉或尿酸鈉結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)、組織、器官的一種臨床綜合征，其臨床主要表現(xiàn)為高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）[2-4]。臨床治療常采用別嘌呤醇和非布司他抑制黃嘌呤氧化酶活性，從而間接遏制人體產(chǎn)生過(guò)高水平的血尿酸，但都存在不同程度的不良反應(yīng)[5-6]。此外，苯溴馬隆通過(guò)抑制腎小管對(duì)尿酸的重吸收，促進(jìn)尿酸排泄降低血液中尿酸濃度，從而實(shí)現(xiàn)降尿酸的目的，但該藥具有強(qiáng)烈的胃腸道反應(yīng)和肝毒性等[7]。面對(duì)痛風(fēng)發(fā)病率逐年增加的趨勢(shì)，亟需尋找低毒、副反應(yīng)小的新型抗痛風(fēng)藥物[8]。

黑樹(shù)莓（Rubus mesogaeus）學(xué)名喜陰懸鉤子，屬于薔薇科懸鉤子，屬多年生落葉灌木，果實(shí)為小漿果，被譽(yù)為天然綠色健康食品[9]，富含生物活性物質(zhì)如黃酮、多酚、花色苷等[10]。黃酮類化合物是一類具有抗腫瘤、降血壓、抗炎、清除自由基等作用，且毒副作用小的天然產(chǎn)物[11-13]。有文獻(xiàn)報(bào)道，植物的黃酮具有抑制黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性，顯示有潛在的抗痛風(fēng)功效[14-15]。民間流傳利用黑樹(shù)莓泡制酒治療痛風(fēng)的偏方，但由于配方欠精準(zhǔn)、泡制工藝較粗放，導(dǎo)致機(jī)理不明確、治療功效不穩(wěn)定[16]。基于前期課題組對(duì)黑樹(shù)莓醇提工藝及其抑制XOD酶學(xué)特性研究的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，黑樹(shù)莓的醇提液可抑制XOD催化黃嘌呤生成尿酸，有緩解痛風(fēng)功效[16-17]。研究表明，蕎麥酒具有降血脂和膽固醇、軟化血管等保健作用[18]。因此，以蕎麥原漿酒代替白酒為酒基制備黑樹(shù)莓泡制酒，以期開(kāi)發(fā)一款具有營(yíng)養(yǎng)保健效果的抗痛風(fēng)產(chǎn)品。

本研究以黑樹(shù)莓為原料、蕎麥原漿酒為酒基進(jìn)行泡制制備黑樹(shù)莓泡制酒，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其泡制工藝條件，采用小鼠高尿酸血癥模型和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)腫脹模型分析黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)小鼠血清和尿液中尿酸含量、血清的XOD活性及關(guān)節(jié)腫脹度變化的影響，以期探究黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)痛風(fēng)的治療效果，為抗痛風(fēng)藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

塔斯州黑樹(shù)莓：浙江省余姚市塔斯州黑樹(shù)莓研究所；黑樹(shù)莓汁（黃酮含量為0.48 mg/mL）：自制；蕎麥原漿酒：市售。

無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)美國(guó)癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）雄性小鼠35只，體質(zhì)量（20.32±1.30）g，周齡6～8周，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK 2014-0001，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于浙江海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度（22±2.4）℃，相對(duì)濕度15%～25%，自由飲水?dāng)z食，每天燈照12 h，定期更換墊料。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸部脫臼處死，之后交由學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一處理。

1.1.2 試劑

尿酸鈉（分析純）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：美國(guó)Sigma公司；別嘌呤醇、苯溴馬?。赫憬凵嚼锟洗笏幏?；尿酸（uric acid，UA）檢測(cè)測(cè)試盒、黃嘌呤氧化酶（XOD）測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所；甲醇（色譜級(jí)）、氧嗪酸鉀、尿酸、氯化鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）、AB-8大孔吸附樹(shù)脂：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

α-1502紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司；Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀：瑞士帝肯M?nnedorf公司；JJ500型電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RV10自動(dòng)控制性旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：迪圖（上海）生物科技有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀：南京利爾實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；MD-99-2A柱層析系統(tǒng)：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑樹(shù)莓泡制酒的制備

以酒精度為47%vol的蕎麥原漿酒作為酒基，蕎麥原漿酒與黑樹(shù)莓按液料比1∶1（mL∶g）在室溫下泡制60 d，制得黑樹(shù)莓泡制酒，總黃酮含量為0.96 mg/mL。

1.3.2 黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

考察液料比（4.0∶1.0、3.0∶1.0、2.0∶1.0、1.5∶1.0、1.0∶1.0（mL∶g））、泡制時(shí)間（15 d、30 d、45 d、60 d、75 d）、蕎麥原漿酒酒精度（39%vol、43%vol、47%vol、51%vol、55%vol）對(duì)XOD抑制率的影響。

1.3.3 黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率（Y）為響應(yīng)值，以影響黑樹(shù)莓常溫泡制效果的液料比（A）、泡制時(shí)間（B）和蕎麥原漿酒酒精度（C）為自變量，對(duì)黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用Design-Expert 11.0.4軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for soaking process optimization of black raspberry soaking spirit

1.3.4 黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制性能測(cè)定

以黃嘌呤為底物，XOD催化黃嘌呤生成的尿酸在波長(zhǎng)290 nm下有明顯的特征吸收峰，參考文獻(xiàn)[19]的方法稍作修改。體系總體積為200 μL，將磷酸緩沖液、黃嘌呤氧化酶溶液、各樣品依次加入96孔板，常溫反應(yīng)30 min，加入不同濃度黃嘌呤，具體加入量見(jiàn)表2。采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)290 nm處每間隔20 s測(cè)定反應(yīng)體系中尿酸的吸光度值，每組平行測(cè)定3次。以XOD抑制劑別嘌呤醇作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸緩沖液為陰性對(duì)照。設(shè)置空白組是排除試劑本身對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。據(jù)此計(jì)算不同樣品在反應(yīng)體系中黃嘌呤氧化酶（25 U/L）的活力，進(jìn)行酶抑制實(shí)驗(yàn)。XOD酶活抑制率的計(jì)算公式如下：

表2 黃嘌呤氧化酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)組別設(shè)計(jì)Table 2 Design of experimental group for xanthine oxidase activity determination μL

1.3.5 試驗(yàn)動(dòng)物的分組及造模

35只SPF級(jí)雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，根據(jù)參考文獻(xiàn)[20-22]按表3隨機(jī)分為7組，具體分組見(jiàn)表3，除正常組按劑量（1 mL/100 g）灌胃小鼠外，其他各組每日上午九時(shí)腹腔注射造模藥物（30 mg/100 g氧嗪酸鉀＋25 mg/100 g尿酸），連續(xù)9 d。在第5天腹腔注射造模藥物后，正常組注射0.05 mL生理鹽水，其余各組注射0.05 mL（25 mg/mL）尿酸鈉誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。從造模第5天開(kāi)始，各組造模1 h后，正常組和模型組給予等體積生理鹽水，其余各組按相應(yīng)劑量灌胃實(shí)驗(yàn)藥物。在第9天造模、給藥后，小鼠禁食不禁水，3 h后收集尿液，新鮮尿樣以3 500 r/min離心10 min，取上清液對(duì)尿液中尿酸含量進(jìn)行測(cè)定。12 h后內(nèi)眥取血，取血樣在3 500 r/min離心10 min，測(cè)定血清中尿酸含量和XOD活力。

表3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組Table 3 Grouping of experimental animal

1.3.6 測(cè)定方法

（1）理化指標(biāo)的檢測(cè)

總黃酮含量的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[23]，以蘆丁的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以波長(zhǎng)505 nm時(shí)的吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=12.57X+0.010 4（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

多酚含量測(cè)定：采用福林酚法，參照文獻(xiàn)[24]方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以波長(zhǎng)765 nm時(shí)的吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，建立沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=11.23X+0.033 3（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中的多酚含量。

花色苷含量的測(cè)定：采用分光光度計(jì)法[25]，以蘆丁不同質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=1.102X-0.010 4Y（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6）。

（2）小鼠體態(tài)觀察

試驗(yàn)期間每天觀察并記錄各組小鼠的毛色、精神狀態(tài)等情況。

（3）平均體質(zhì)量和食量的變化

每天實(shí)驗(yàn)前固定時(shí)間記錄各組小鼠平均體質(zhì)量和飼料質(zhì)量，評(píng)估實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的影響。

（4）血清、尿液中尿酸含量的檢測(cè)

按《尿酸（UA）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)》測(cè)定各組小鼠血清和尿液中尿酸的含量。

（5）血清中XOD活力的檢測(cè)

按《黃嘌呤氧化酶（XOD）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)》測(cè)定各組小鼠血清中XOD的活力。

（6）關(guān)節(jié)腫脹度的測(cè)量

在實(shí)驗(yàn)的第5天造模、給藥前，用記號(hào)筆標(biāo)注小鼠受試部位，采用縛線法測(cè)量小鼠原始周長(zhǎng)，注射尿酸鈉混懸液后分別記錄0 h、2 h、4 h、8 h的小鼠關(guān)節(jié)注射部位的周長(zhǎng)，計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度，其計(jì)算公式如下：

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件OriginPro 8.0進(jìn)行繪圖，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及顯著性、相關(guān)性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

料液比、泡制時(shí)間和酒精度對(duì)XOD抑制率的影響見(jiàn)圖1。由圖1A可知，隨著液料比在4.0∶1.0～1.5∶1.0（mL∶g）范圍內(nèi)的升高，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD酶的抑制率也逐漸增加；當(dāng)液料比為1.5∶1.0（mL∶g）時(shí)，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率為40.98%；液料比＞1.5∶1.0（mL∶g）后，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率逐漸平穩(wěn)。因此，確定最適的液料比為1.5∶1.0（mL∶g）。由圖1B可知，隨著泡制時(shí)間在15～60 d范圍內(nèi)的增加，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率增加較快；當(dāng)泡制時(shí)間為60 d時(shí)，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率為41.23%；但泡制時(shí)間＞60 d后，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率增長(zhǎng)變緩。因此，確定最適的泡制時(shí)間為60 d。由圖1C可知，隨著酒精度的在39%vol～55%vol范圍內(nèi)增加，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率逐漸增加；當(dāng)酒精度為47%vol時(shí)，XOD的抑制率為39.85%；但當(dāng)酒精度＞47%vol之后，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率增加緩慢。因此，確定最適的酒精度為47%vol。

圖1 液料比（A）、泡制時(shí)間（B）及酒精度（C）對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率的影響Fig.1 Effects of liquid and solid ratio (A),soaking time (B) and alcohol content (C) on the inhibition rate of xanthine oxidase

2.2 黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 泡制工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比（A）、泡制時(shí)間（B）、酒精度（C）為考察因素，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD的抑制率（Y）為響應(yīng)值，采用基于Box-Benhnken設(shè)計(jì)的3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 黑樹(shù)莓泡制酒泡制工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Benhnken experiments for soaking process optimization of black raspberry soaking spirit

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 11.0.4軟件對(duì)表4的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到響應(yīng)值與各因素間的回歸方程：

由表5可知，該回歸模型極顯著（P值=0.000 2＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P值=0.688 5＞0.05），說(shuō)明此試驗(yàn)的模型設(shè)計(jì)合理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度高。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。各因素的F值可以反映各因素對(duì)XOD抑制率的重要性，F(xiàn)值越大說(shuō)明對(duì)XOD抑制率的影響越大。由F值可知，3個(gè)因素對(duì)黑樹(shù)莓泡制酒XOD抑制率影響的主次順序?yàn)榕葜茣r(shí)間（B）＞液料比（A）＞酒精度（C）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

三維響應(yīng)曲面圖可以非常直觀地反映出液料比、泡制時(shí)間、酒精度交互作用對(duì)XOD抑制率的影響，各因素間交互作用對(duì)XOD抑制率影響的響應(yīng)曲面及等高線見(jiàn)圖2。

圖2 各因素間交互作用對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on inhibition rate of xanthine oxidase

由圖2可知，泡制時(shí)間（B）與液料比（A）交互作用的曲面較陡峭，表明二者交互作用對(duì)XOD抑制率影響顯著（P＜0.05），而酒精度與液料比、酒精度與泡制時(shí)間交互作用的曲面較為平緩，表明二者有交互作用，但交互作用不顯著（P＞0.05），這與回歸模型方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)軟件分析，黑樹(shù)莓泡制酒的最佳泡制工藝條件為：液料比1.03∶1.00（mL∶g）、泡制時(shí)間60 d、蕎麥原漿酒酒精度48.98%vol，此時(shí)XOD抑制率理論值為43.13%。綜合考慮3因素對(duì)XOD酶活的影響程度和實(shí)際操作成本，將最優(yōu)泡制工藝條件適當(dāng)調(diào)整為液料比1∶1（mL∶g），泡制時(shí)間60 d，蕎麥原漿酒酒精度為49%vol。在此優(yōu)化泡制工藝條件下，XOD抑制率的實(shí)際值為（42.68±0.61）%，實(shí)際值和理論值的相對(duì)誤差為0.45%。黑樹(shù)莓泡制酒的總黃酮含量為（0.965 8±0.004 8）mg/mL，多酚含量為（0.937 4±0.003 2）mg/mL、花色苷含量為（0.013 4±0.000 4）mg/mL，以XOD抑制率為判定條件，說(shuō)明建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可行，符合預(yù)期結(jié)果，可以作為黑樹(shù)莓泡制酒工藝條件確定的依據(jù)。

2.3 黑樹(shù)莓泡制酒抗痛風(fēng)功效評(píng)價(jià)

2.3.1 小鼠的體態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)期間，空白組小鼠的精神狀態(tài)良好，毛發(fā)順滑有光澤，反應(yīng)迅速，飲食正常。模型組小鼠的的反應(yīng)減緩，精神不振，毛發(fā)失去明顯的光澤。各組小鼠關(guān)節(jié)注射尿酸鈉后，正常組注射生理鹽水后行動(dòng)有明顯的跛腳，隨時(shí)間延長(zhǎng)，除模型組外，跛腳現(xiàn)象逐漸消失。

2.3.2 小鼠平均體質(zhì)量及食量

在小鼠實(shí)驗(yàn)期間，稱量并記錄每天的體質(zhì)量和進(jìn)食量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率及食量的影響Table 6 Effect of black raspberry soaking spirit on body mass growth rate and food intake in mice

由表6可知，各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率均顯著低于正常組（P＜0.01），除別嘌呤醇組外，其余各組小鼠每天的平均食量也顯著低于正常組（P＜0.05），說(shuō)明造模對(duì)小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)率以及食量具有顯著影響（P＜0.05）。與模型組相比，苯溴馬隆組在食量上差異顯著（P＜0.05），體質(zhì)量增長(zhǎng)率不顯著（P＞0.05）。別嘌呤醇組的小鼠在體質(zhì)量增長(zhǎng)率以及食量方面顯著增加（P＜0.05）。黑樹(shù)莓泡制酒高劑量組以及黑樹(shù)莓汁液組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)率及食量均顯著小于模型組（P＜0.05），其原因可能是高濃度的黑樹(shù)莓泡制酒及黑樹(shù)莓汁液影響小鼠的食欲，營(yíng)養(yǎng)攝入不全面導(dǎo)致體質(zhì)量增長(zhǎng)率較低；而黑樹(shù)莓泡制酒低劑量組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率與模型組差異不顯著（P＞0.05），但食量顯著增加（P＜0.05）。

2.3.3 小鼠血清及尿液中的尿酸含量

藥物對(duì)高尿酸血癥的作用主要通過(guò)小鼠血清中尿酸含量的高低來(lái)進(jìn)行判定，此外通過(guò)測(cè)定小鼠尿液中尿酸含量也可以從側(cè)面反映藥物對(duì)尿酸排泄的效果。各組小鼠血清尿酸含量及尿液尿酸含量見(jiàn)圖3。

圖3 黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)高尿酸血癥小鼠血清和尿液中尿酸水平的影響Fig.3 Effect of black raspberry soaking spirit on uric acid levels in serum and urine of hyperuricemia mice

由圖3可知，與正常組相比，模型組小鼠血清和尿液中的尿酸含量升高明顯，差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的高尿酸血癥小鼠模型構(gòu)建成功。與模型組比較，除黑樹(shù)莓汁液組外，苯溴馬隆組、別嘌呤醇組、黑樹(shù)莓泡制酒高劑量組、黑樹(shù)莓泡制酒低劑量組中小鼠血清尿酸含量顯著降低（P＜0.05），各組別分別下降136.24 μmol/L、148.80 μmol/L、121.93 μmol/L、101.38 μmol/L（P＜0.05），尿液中尿酸含量顯著升高（P＜0.05），各組別分別升高172.68 μmol/L、157.29 μmol/L、131.78 μmol/L、105.64 μmol/L（P＜0.05）。由此說(shuō)明黑樹(shù)莓泡制酒可有效降低血清中尿酸含量，促進(jìn)尿酸的排出，黑樹(shù)莓泡制酒高劑量組與別嘌呤醇組尿液尿酸含量差異不顯著（P＞0.05），其血清尿酸含量與苯溴馬隆組差異不顯著（P＞0.05），別嘌呤醇的藥理作用是抑制XOD的酶活來(lái)抑制尿酸的形成，苯溴馬隆的藥理作用是抑制腎小管對(duì)尿酸的重吸收來(lái)降低血中尿酸含量[26]，促進(jìn)尿液尿酸的排出，黑樹(shù)莓泡制酒降尿酸的機(jī)制是否兼而有之有待進(jìn)一步探究。

2.3.4 小鼠血清的XOD活力

XOD在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸，過(guò)多的尿酸會(huì)導(dǎo)致高尿酸血癥[22]。目前通過(guò)抑制體內(nèi)XOD的活性，阻斷XOD催化嘌呤生成尿酸的途徑，從而降低血液中的尿酸水平。各組小鼠血清中XOD活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)高尿酸血癥小鼠血清中黃嘌呤氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of black raspberry soaking spirit on xanthine oxidase activity in serum of hyperuricemia mice

由圖4可知，與正常組相比，模型組XOD活力顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，別嘌呤醇組、黑樹(shù)莓泡制酒高劑量組和黑樹(shù)莓泡制酒低劑量組小鼠血清中的XOD活力水平顯著降低（P＜0.05），各組別分別下降20.07 U/L、13.93 U/L、7.31 U/L（P＜0.05），黑樹(shù)莓泡制酒和別嘌呤醇可以抑制XOD的活性，減少尿酸含量的生成，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和李昕卓等[27]的研究結(jié)果一致，但黑樹(shù)莓泡制酒高劑量組、低劑量組抑制XOD的活性顯著低于別嘌呤醇組（P＜0.05）。苯溴馬隆組小鼠血清中XOD活力水平和模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05），這與苯溴馬隆的藥理作用機(jī)制有關(guān)。黑樹(shù)莓汁液組的XOD活力水平與模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明灌胃黑樹(shù)莓汁液對(duì)小鼠血清X(qián)OD活力無(wú)影響。

2.3.5 小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度

采用穿刺法在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射尿酸鈉誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，尿酸鈉注射前后小鼠關(guān)節(jié)對(duì)比見(jiàn)圖5，各組別不同時(shí)間對(duì)關(guān)節(jié)腫脹度的影響見(jiàn)表7。

圖5 尿酸鈉注射前后小鼠關(guān)節(jié)對(duì)比Fig.5 Comparison of mouse joints before and after sodium urate injection

表7 注射尿酸鈉的不同時(shí)間對(duì)各組別小鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響Table 7 Effect of injection time of sodium urate on the joint swelling degree in each group of mice

由圖5可知，小鼠關(guān)節(jié)在注射尿酸鈉之后出現(xiàn)腫脹。由表7可知，正常組與樣品組注射等量的生理鹽水后，關(guān)節(jié)出現(xiàn)一定程度的腫脹，但隨生理鹽水的吸收腫脹快速消失，至8 h腫脹已完全消除。與正常組小鼠相比，注射完成后，模型組小鼠關(guān)節(jié)腫脹度極顯著高于正常組（P＜0.01），表明關(guān)節(jié)注射尿酸鈉導(dǎo)致的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型成功；實(shí)驗(yàn)期間各藥物組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度與正常組相比均有極顯著差異（P＜0.01）。與模型組相比，注射2 h后，正常組、苯溴馬隆組、黑樹(shù)莓泡制酒高劑量組、黑樹(shù)莓泡制酒低劑量組小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度均極顯著降低（P＜0.01），各組別分別降低12.36%、7.03%、5.37%、3.95%，說(shuō)明黑樹(shù)莓泡制酒可降低小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度。苯溴馬隆能夠極顯著降低關(guān)節(jié)腫脹度（P＜0.01），苯溴馬隆組的消腫效果好，與苯溴馬隆通過(guò)抑制腎小管對(duì)尿酸的重吸收，促進(jìn)尿酸排泄的藥理作用有關(guān)[26]。別嘌呤醇組以及黑樹(shù)莓汁液組關(guān)節(jié)腫脹度下降不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本研究以黑樹(shù)莓為原料、蕎麥原漿酒為酒基進(jìn)行泡制制備黑樹(shù)莓泡制酒，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定黑樹(shù)莓泡制酒的最佳泡制工藝條件為：液料比1∶1（mL∶g）、泡制時(shí)間60 d、蕎麥原漿酒酒精度49%vol。在此優(yōu)化工藝條件下，黑樹(shù)莓泡制酒對(duì)XOD活性的抑制率達(dá)到42.68%，總黃酮、多酚、花色苷含量分別為0.97 mg/mL、0.94 mg/mL、0.01 mg/mL。黑樹(shù)莓泡制酒能夠有效降低高尿酸血癥小鼠血清中尿酸的含量，促進(jìn)尿酸的排泄，可以抑制小鼠血清中的XOD活力，對(duì)小鼠的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎也有明顯的消腫作用。高濃度的黑樹(shù)莓泡制酒分別與別嘌呤醇促進(jìn)尿酸排出、苯溴馬隆降低血清尿酸的功效相當(dāng)，下一步將對(duì)黑樹(shù)莓泡制酒的藥理作用機(jī)制進(jìn)行研究。