六妹羊肚菌原生質體再生菌株交配型的分離鑒定

劉 彬，刁文濤，周伏忠*，陳曉飛，寧 萌，郭 恒

（河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008）

羊肚菌（Morchella）是一種珍稀食藥用菌，富含氨基酸、多糖、礦質元素等多種營養成分，具有抗腫瘤、抗菌、保護心血管、增強免疫力等功效[1]。近年來，我國羊肚菌人工栽培技術取得重要進展，在“外營養袋”栽培模式引領下，我國易出菇羊肚菌品種，如梯棱羊肚菌（Morchella importuna）、六妹羊肚菌（Morchella sextelata）和七妹羊肚菌（Morchella eximia）的商業化栽培迅猛發展，栽培面積已超過8 000 hm2且仍在不斷增加，然而在羊肚菌產業快速發展的同時，每年有50%～70%的種植者無法穩定盈利、重返貧困或負債[2-4]。其原因是，羊肚菌菌種不穩定、易老化退化（如異核體中交配型丟失、線粒體氧化功能衰退等）以及管理不當帶來商業化栽培時產量不穩定（0～500 kg鮮菇/畝）是制約我國羊肚菌栽培成敗的關鍵因素[5-7]。

羊肚菌是一種單極性異宗結合子囊菌，其菌絲細胞的細胞核數量在15～42個不等，其子囊孢子內含有18～32個細胞核，子囊孢子剛萌發芽管菌絲細胞也含有4～22個細胞核，無性孢子（暨分生孢子）大多單核，然而，在目前實驗室條件下，無法誘導無性孢子穩定產生和有效萌發[8-10]，這些情況不利于羊肚菌遺傳育種工作的深入開展。植物原生質體技術在食藥用菌遺傳育種中的應用顯示出獨特優勢，如實驗室易于操作、試驗周期短、不受子實體栽培季節限制、可以進行單交配型菌株或單核體的快速分離、誘變、雜交及細胞融合等。利用原生質體技術分離交配型及單核體的分析研究，在擔子菌類食藥用菌中研究較多，如應用原生質體單核化技術分別分離到香菇（Lentinus edodes）[11-13]、大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）[14]、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）[15-16]、金針菇（Flammulina velutipes）[17]、猴頭菇（Hericium erinaceus）[18]等不同食藥用菌的單交配型菌株，并開展了不同交配型單核體的生理生化差異性、遺傳誘變和雜交育種等分析研究；而子囊菌類食藥用菌中利用原生質體技術進行交配型及同核體分離的研究報道較少，劉偉等[19]利用原生質體單細胞技術可分離到梯棱羊肚菌（M.importuna）的單交配型同核體，目前還未見采用原生質體技術對六妹羊肚菌交配型（mating type，MAT）進行分離的研究報道。

本研究對六妹羊肚菌（M.sextelata）原生質體進行制備及再生，且對分離后的原生質體再生菌株的交配型進行分子生物學鑒定，并對其交配型穩定性進行驗證試驗，以期實現羊肚菌交配型的有效分離，對六妹羊肚菌的遺傳育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與引物

栽培種分離的六妹羊肚菌（Morchella sextelata）：河南省微生物工程重點實驗室分離、保存。交配型基因的上游引物（P6-1F、P8-4F）及下游引物（P6-1R、P8-4R）參照文獻[20]的序列，由華大基因公司提供合成服務。其中引物對P6-1F/P6-1R用于檢測交配型MAT1-2-1基因，引物對P8-4F/P8-4R用于擴增交配型MAT1-1-1基因。

1.1.2 試劑

瓊脂糖、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、酵母提取物（粉）（均為生化試劑）：天津市致遠化學試劑有限公司；溶壁酶（18 000 U/g）：廣東省微生物所；纖維素酶（7 000 U/g）、蝸牛酶（破壁率90%）、亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、GenSTAR Stain RED核酸染料：北京康潤誠業生物科技有限公司；2×ESTaqMaster Mix試劑盒：北京天根生化科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：上海萊楓生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

完全酵母提取物培養基（complete yeast extract medium，CYM）（CYM再生培養基）：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、酵母粉0.1%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.046%、磷酸氫二鉀0.1%、瓊脂1.5%（液體培養基不添加）、0.6 mol/L甘露醇（再生培養基中添加）、蒸餾水配制，pH值自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：土豆200 g，切片、煮沸10 min，3～4層紗布過濾取濾液，加入葡萄糖2%、瓊脂1.5%，蒸餾水配制，pH值自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺：上海滬凈凈化設備有限公司；TCYQ型全溫搖瓶柜：太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司；DDY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；Chemi DocTMXRS+化學發光凝膠成像系統：美國BIO-RAD公司；MIKRO 22R離心機：德國Hettich公司；MULTIFUGE X1R離心機：美國Thermo scientific 公司；Tpersonal聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：法國Biometra公司；UV8C18/2HJ型紫外誘變箱：北京賽百奧科技有限公司；BMXSP-10CA顯微鏡：上海彼愛姆公司；ZEISS Axio Imager M2型全電動正置熒光顯微鏡：德國ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 原生質體的制備

（1）CYM液態培養法

將六妹羊肚菌等菌株接種于置有玻璃紙（直徑8.5～9.0 cm）的CYM平板上，24 ℃倒置培養72 h，長刀片刮下轉接于CYM液體培養基中，24 ℃靜置培養3～4 d，過濾收集幼嫩菌絲體，用無菌水、甘露醇洗滌4次；加入混合酶液中（2%溶壁酶+1%纖維素酶+1%蝸牛酶，0.22 μm濾膜過濾滅菌），于30 ℃、60 r/min條件下酶解2.5～3.5 h，酶解后的原生質體粗酶液通過G2燒結玻璃漏斗過濾分離原生質體和菌絲片段，原生質體濾液用0.6 mol/L甘露醇進行離心（4 000 r/min、10 min）、洗滌和濃縮（重復2～3次，離心前在離心管中預先加入60%蔗糖墊在離心管底部），得到純凈的原生質體濃縮液，采用血球計數板對酶解液和濃縮液中的原生質體進行計數。

（2）玻璃紙CYM平板培養法

挑取六妹羊肚菌等菌株2塊，接種于置有玻璃紙（直徑8.5～9.0 cm）的CYM平板上，24 ℃倒置培養72 h，長刀片刮下幼嫩菌絲，采用上述方法制備原生質體濃縮液。

1.3.2 原生質體的再生

原生質體濃縮液用0.6 mol/L甘露醇適當稀釋后取100～200 μL涂布于CYM再生培養基平板進行再生培養，或對涂布于CYM再生培養基平板上的原生質體進行紫外線（ultraviolet，UV）誘變后再進行再生培養（紫外誘變條件：18 W紫外燈、距離32 cm、照射30 s，紅光燈下操作）；再生培養條件：CYM再生培養基平板正立靜置30 min后封口膜封口、24 ℃倒置培養65～120 h，采用血球計數板進行原生質體計數，觀察原生質體的再生情況并計算回收率及再生率，其計算公式如下：

1.3.3 原生質體再生菌株的分離及其交配型的鑒定

（1）原生質體再生菌株的分離

小心挑取CYM再生培養基平板上出現的單菌落至PDA培養基斜面上，編號后置于24 ℃生化培養箱中培養7～14 d，或對經紫外誘變（原生質體稀釋溶液于18 W紫外燈下距離32 cm處照射30 s）原生質體再生單菌落進行編號，并將單菌落接種于PDA培養基斜面進行培養后，于4～12 ℃冰箱保藏。

（2）原生質體再生菌株的交配型鑒定

取斜面保藏菌株的少量菌絲于2 mL離心管內，加入300 μL細胞壁裂解液[1%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2%乙酸鋰]、少量玻璃珠，研磨2～3 min，75 ℃水浴20min，取上清100μL，加入無水乙醇300μL，12000r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入400μL體積分數70%乙醇，12000r/min離心5min，棄去上清液，DNA沉淀風干20min；風干后的DNA用50 μL雙蒸水（ddH2O）溶解、振蕩懸浮，作為DNA模板，進行PCR擴增。

PCR擴增體系（15 μL）：2×ESTaqMaster Mix 7.5 μL，P8-4F/P8-4R引物對或P6-1F/P6-1R引物對（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）5.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，共35個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR擴增產物的電泳：1.0%瓊脂糖凝膠加熱溶解，然后加入1 μL核酸染料，倒入電泳膠槽，凝固后進行點樣和電泳檢測，其條件為：130 V、160 A，20～25 min。

1.3.4 再生菌株的交配型穩定性驗證

在完成原生質體再生菌株的分離和交配型鑒定的基礎上，選取代表性的單交配型再生菌株（UV-31、UV-42和3PK-65）和雙交配型再生菌株（6M2P-24），按照1.3.1的方法再次進行菌絲體培養、原生質體制備、濃縮，經理化誘變后對其“第二代”原生質體再生菌株進行分離及其交配型鑒定；期間開展紫外線輻照誘變和亞硝基胍化學誘變，其中原生質體的紫外線誘變處理：紫外燈功率18 W、照射距離32 cm、照射時間30 s；原生質體的亞硝基胍誘變方法：液體培養48 h的菌絲體中加入0.25 mg/mL亞硝基胍，誘變處理30 min（室溫、間歇搖動），誘變后用無菌水洗滌4次；G2漏斗過濾收集菌絲體，0.6 mol/L甘露醇洗滌2次，擠去液體，菌絲體塊轉入50 mL三角瓶中，加入混合酶液進行原生質體制備、濃縮、再生等操作。

1.3.5 細胞核的熒光染色

制備的六妹羊肚菌原生質體及其再生菌絲體用質量濃度4 μg/mL的DAPI染料進行細胞核染色，室溫下避光染色10～15 min，立刻進行顯微觀察（激發波長365 nm，發射波長420～470 nm）。

2 結果與分析

2.1 六妹羊肚菌原生質體的制備和再生

六妹羊肚菌原生質體濃度達（0.6～4.5）×105個/mL（CYM液體法）或（2.2～4.5）×106個/mL（玻璃紙CYM平板法），原生質體直徑在2～6 μm之間；其中CYM液體法制備的原生質體回收率（60%～80%）和再生率（0.15%～9.00%）明顯高于玻璃紙CYM平板法（5%～20%和0.05%～0.16%）；可見六妹羊肚菌原生質體的酶解和再生參數與前人報道粗柄羊肚菌、尖頂羊肚菌等子囊菌、香菇、平菇、金針菇等擔子菌的酶解條件基本一致，但產量偏低[21-25]；同時實驗發現，六妹羊肚菌液體培養法制備的原生質體在回收率、再生率等方面更有利于后續的遺傳育種研究工作。

2.2 六妹羊肚菌原生質體再生菌株的分離及其交配型的鑒定

本實驗共分離獲得200余株六妹羊肚菌的原生質體再生單菌落，從中獲得有效生長菌株182株，對菌株的交配型進行PCR鑒定，鑒定結果見表1。

表1 六妹羊肚菌原生質體再生菌株的交配型PCR鑒定結果Table 1 PCR identification results of mating types of regenerated strains from protoplast of Morchella sextelata

由表1可知，182株菌株中MAT1-1-1單交配型菌株共63株，占比34.62%；MAT1-2-1單交配型菌株共45株，占比24.73%；同時含有MAT1-2-1和MAT1-2-1兩種交配型的雙交配型菌株共66株，占比36.26%；同時還有8株未能擴增出交配型基因的“雙陰性”菌落，占比4.40%，可能是菌株老化引起的細胞核自溶（觀察到“雙陰性”菌落大部分為產深褐色色素的菌株），具體原因有待進一步實驗。

傳統的羊肚菌單交配型同核體的獲取多采用子囊果組織分離或毛細管顯微操作的方法，如劉偉等[27]采用組織分離法從多個羊肚菌子囊果中分離到單一交配型基因的同核體菌株，并發現其子囊果組織中存在交配型缺失現象（交配型缺失比例達43.96%）。劉萍等[28]采取毛細管單孢分離法從多種羊肚菌子囊果中分離到子囊孢子單交配型及雙交配型單孢菌株，并通過單孢菌株對峙培養實驗發現羊肚菌中存在性親和但營養體不親和的現象。本實驗研究證實，通過原生質體單核化的方法能有效實現羊肚菌交配型的分離。代表性的六妹羊肚菌原生質體再生菌落的交配型PCR檢測的電泳結果見圖1。

圖1 六妹羊肚菌再生菌株交配型的PCR檢測結果Fig.1 PCR testing results of mating type of regenerated strains of Morchella sextelata

由圖1可知，泳道1和2、3和4、7和8、21和22代表的4個菌株（UV-84、UV-85、UV-87和UV-5）只有P8-4F/P8-4R引物對擴增出條帶，為MAT1-1-1單交配型菌株，泳道5和6、11和12、13和14、23和24代表的4個菌株（UV-86、UV-89、UV-90和UV-7）只有P6-1F/P6-1R引物對擴增出條帶，為MAT1-2-1單交配型菌株，而泳道9和10、15和16、17和18、19和20代表的4個菌株（UV-88、UV-91、UV-92和UV-4）P6-1F/P6-1R、P8-4F/P8-4R兩組引物對都擴增出條帶，為交配型MAT1-1-1/MAT1-2-1的雙極性菌株（異核體）。

2.3 原生質體再生菌株的交配型穩定性驗證

本實驗進一步測試了六妹羊肚菌原生質體再生菌落的交配型的穩定性，六妹羊肚菌原生質體再生菌株的“第二代”再生菌落的交配型的PCR檢測結果見表2。

表2 六妹羊肚菌原生質體的“第二代”再生菌株交配型的PCR檢測結果Table 2 PCR testing results of mating types of "second generation"regenerated strains from protoplast of Morchella sextelata

由表2可知，六妹羊肚菌的“同核體”再生菌絲體，再次經過原生質體化過程、紫外線（UV）、亞硝基胍（NTG）等處理（誘變結果數據未列出），其交配型沒有改變或丟失，與親本菌株的交配型一致（其中六妹羊肚菌UV31系列19株，UV42系列10株的交配型均穩定表現為MAT1-1-1，六妹羊肚菌3PK65系列22株的交配型穩定表現為MAT1-2-1）；同時由表2可知，六妹羊肚菌原生質體雙極性再生菌株（6M2P245G系列，異核體）的“第二代”原生質體再生菌落中再次發生了兩種交配型分離的現象。

2.4 六妹羊肚菌原生質體細胞核的染色觀察

六妹羊肚菌原生質體中細胞核的顯微觀察見圖2。

圖2 六妹羊肚菌原生質體中細胞核的顯微鏡觀察結果Fig.2 Microscopic observation results of nuclei in protoplasts of Morchella sextelata

由圖2A可知，六妹羊肚菌原生質體形成過程中，每個原生質體細胞包裹的細胞核數量比菌絲細胞大幅減少，只有1個細胞核充盈整個原生質體，或少量的含有0～3個細胞核；由圖2B可知，六妹羊肚菌的幼嫩菌絲或尖端菌絲細胞中細胞核是多核的。本實驗對六妹羊肚菌的原生質體細胞核染色觀察佐證了原生質體方法分離羊肚菌單核菌絲體或單交配型菌株的可行性。

3 結論

本研究對六妹羊肚菌原生質體再生菌株的交配型分離及穩定性情況進行了較為系統的分析研究，共獲得182株有效生長菌株，妹羊肚菌原生質體再生菌株中MAT1-1-1交配型菌株達34.62%，MAT1-2-1交配型菌株24.73%，單交配型菌株比例近60%（59.35%）；而且單交配型菌株經過理化誘變處理（紫外線、亞硝基胍等）的處理，交配型與親本一致，具有很強的遺傳穩定性。細胞核染色實驗也證實六妹羊肚菌原生質體中只含有0～3個細胞核，這種單核或少核狀態的原生質體十分有利于后續的羊肚菌單一背景遺傳材料如交配型的獲取、遺傳誘變以及親和性分析等研究。