桑椹葡萄復合果酒發酵工藝響應面法優化及其風味特征

季明月，龔建剛，羅建華，2，BIMAL CHITRAKAR，敖常偉，檀建新

（1.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071001；2.懷來縣貴族莊園葡萄酒有限公司，河北 張家口 075400）

桑椹（Morus nigra）含有很多營養素和有益健康的生物活性化合物[1]，如褪黑素[2]、多酚化合物[3]、白藜蘆醇[4]、類黃酮[5]、花青素[6]和多糖[7]。這些化合物具有多種生物活性，包括抗血栓[8]、抗氧化劑[9]、抗肥胖[10]、抗炎[11]、抗癌[12]和神經保護[13]。因此，桑椹自古以來就被用作傳統藥物[14]，被中國藥典認定為藥食同源的食物。新鮮桑椹常被加工成桑椹干、桑椹膏及桑椹酒等，桑椹酒因含有豐富的生物活性物質而深受消費者青睞。

桑椹酒和干紅葡萄酒顏色相似，都含有大量花青素[15-16]。但因為原料不同，其營養物質和風味各有不同，兩者都含有豐富的抗氧化物，葡萄酒中的胡蘿卜素高于桑椹酒，但桑椹酒中的花青素、白藜蘆醇、黃酮類化合物、硒元素、維生素E等均要高于葡萄酒[17]。LIU S J等[18]研究表明，適宜的酵母菌株能減少桑椹酒發酵過程中花青素的降解、顏色褐變及抗氧化活性，提高果酒風味和品質。左勇等[19]以酵母A2為菌種釀造桑椹果酒，打漿時添加了適量的水、亞硫酸溶液和葡萄糖，在SO2質量濃度為70 mg/L、糖度為170 g/L，接種量9%、26 ℃條件下進行酒精發酵。赫連遠坤等[20]采用1%鹽水、1%淀粉液和自來水清洗赤霞珠葡萄，破碎后的葡萄漿接種活化后的活性干酵母ST進行發酵，結果表明，用1%鹽水或1%淀粉液清洗能去除較多的霉菌和細菌，提高釀酒葡萄潔凈度，有利于葡萄酒發酵產乙醇及風味復雜性。OBERHOLSTERA等[21]研究明膠、蛋清和錯流微濾對葡萄酒酚類物質的影響，以期通過工藝改善提高葡萄酒品質。

桑椹酒風味獨特，但較葡萄酒顯得單一。此外，桑椹酒產量和認同度遠遠低于葡萄酒。如將桑椹和葡萄釀造成桑椹葡萄復合果酒，則可以集兩者之優勢于一體，開發一款獨具特色的復合果酒。本研究以桑椹品種黑珍珠與釀酒葡萄品種赤霞珠為原料，制備桑椹葡萄復合果酒。探討不同比例桑椹葡萄混合發酵的果酒的風味特征，采用單因素試驗及響應面試驗篩選其最佳發酵工藝，并通過氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術分析桑椹葡萄復合果酒的香氣成分特征，研制桑椹葡萄復合果酒，可滿足人們對營養保健、口感風味、時尚生活的不同需求，為工業化生產桑椹葡萄復合果酒提供技術支撐。同時可在一定程度上解決桑椹深加工問題，豐富果酒產品，促進果酒市場發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹（品種黑珍珠）：河北金桑園農業發展有限公司；葡萄（品種赤霞珠）：市售；安琪牌果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；白砂糖（食品級）：市售；無水檸檬酸、偏重亞硫酸鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BL-300-X電子天平：廈門百倫斯電子科技有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；STARTER 3100 pH計：上海奧豪斯儀器有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；安捷倫7890A-5975C氣質聯用（GC-MS）系統：美國安捷倫公司；TG-WAXMS毛細管柱：美國賽默飛世爾（中國）科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 桑椹葡萄復合果酒加工工藝流程及操作要點

操作要點：將桑椹、葡萄清洗，瀝干水分后，按照一定質量比混合、破碎，根據預設復合果酒15%vol的酒精度加糖，混合破碎好的果汁中加入偏重亞硫酸鉀（以SO2計，終濃度為60 mg/L）和300 mg/L的果膠酶，于10 ℃培養箱中浸漬16 h。稱取1 g的活性干酵母于燒杯中，再加入10 mL的桑葚葡萄混合果汁，在37 ℃條件下活化30～40 min，活化酵母接入混合果汁中，于23 ℃條件下進行酒精發酵（測定酒液比重，保持穩定不變即為酒精發酵結束），酒精發酵結束后，用紗布進行皮渣分離，在18 ℃條件下進行20 d蘋果酸-乳酸發酵，30 mg/L蛋清粉下膠處理酒樣2 d，過濾澄清得到原酒，酒裝瓶后于水浴鍋70 ℃殺菌10 min，取出冷卻即為桑椹葡萄復合果酒成品。

1.3.2 桑椹與葡萄質量比對桑椹葡萄復合果酒品質的影響

試驗設6組處理，其桑椹與葡萄質量比分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、0∶1，編號為1～6號，每組3個重復。分別測定1～6號桑椹葡萄復合果酒樣品的初始糖含量及發酵參數，并對其進行感官評價，確定最佳桑椹和葡萄質量比。

1.3.3 分析檢測

酒精度、酸度、總糖、可溶性固形物等理化指標與感官指標的測定，參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。感官評定標準見表1。

表1 桑椹葡萄復合果酒感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of mulberry-grape compound fruit wine

1.3.4 桑椹葡萄復合果酒發酵工藝優化

單因素試驗：在確定桑椹和葡萄質量比后，分別設置酵母添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，發酵時間為3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，發酵溫度為17 ℃、20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃進行發酵工藝優化單因素試驗，考察酵母添加量、發酵時間、發酵溫度對桑椹葡萄復合果酒酒精度及感官評分的影響。

響應面試驗設計：在單因素試驗基礎上，選取對桑椹葡萄復合果酒發酵影響較大的發酵溫度（A）、酵母接種量（B）、發酵時間（C）作為自變量，以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面分析試驗。Box-Behnken試驗設計因素水平見表2。

表2 桑椹葡萄復合果酒發酵工藝優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation technology optimization of mulberry-grape compound fruit wine

1.3.5 復合果酒揮發性風味物質GC-MS分析

通過固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）提取桑椹葡萄復合果酒樣品中的香氣化合物，采用GC-MS法進行分析[23]。

樣品前處理：將含有7.5 mL桑椹葡萄復合果酒樣品、2 g NaCl和25 μL三辛醇內標的混合物放入18 mL樣品瓶中。將50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取頭插入由聚四氟乙烯-硅隔膜密封的樣品瓶中，在40 ℃下溫浴52 min萃取，解吸6 min，使用安捷倫7890A-5975C GC/MS系統進行揮發性香氣化合物分析[24]。

氣相色譜條件：TG-WAXMS毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He），流速為1 mL/min。升溫程序：在50 ℃的初始溫度下保持2 min，隨后，以3 ℃/min的速率將溫度升高至80 ℃，然后以5 ℃/min的速率再升高至230 ℃，230 ℃下保持6 min[25]。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：4 min；增益系數：1；質量掃描范圍在20～450 m/z[26]。

定性定量方法：使用安捷倫科技公司5977A化學站軟件確定每個峰的面積。美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標準庫自動檢索化合物的質譜數據，然后參考相對標準光譜圖進行化合物定性分析。采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，進行定量分析[27]。

1.3.6 數據處理

數據處理采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS.20.0軟件，顯著性分析采用最小顯著差別（least significant dif ference，LSD）和Duncan（D）進行假定方差齊性檢驗，P＜0.05表示差異達到顯著水平。

2 結果與分析

2.1 桑椹和葡萄質量比的確定

2.1.1 不同桑椹和葡萄質量比對桑椹葡萄復合果酒初始糖含量及發酵參數的影響

不同桑椹和葡萄質量比對桑椹葡萄復合果酒理化指標的影響見表3。由表3可知，隨著葡萄果實比例的增加，初始糖含量呈上升趨勢（90～250.3 g/L），表明葡萄比桑椹含糖量更高。為了將各組的初始糖含量調整為等量（250 g/L），在樣品1號至5號之間向各組添加適量蔗糖。酒精發酵結束后，1號樣品的酒精度為11.20%vol，是六組中的最低值，這意味著某些糖或其他有機物無法通過酵母完全轉化為酒精。桑椹和葡萄的質量比越低，發酵后剩余的總糖越低。另一方面，1號樣品的可溶性固形物含量和總酸顯著高于其他組，其他各組樣品差異不大。考慮到白砂糖的添加量、桑椹葡萄復合果酒的風味等因素，選擇最適桑椹和葡萄質量比為1∶4。

表3 不同桑椹和葡萄質量比對桑椹葡萄復合果酒初始含糖量及發酵參數的影響Table 3 Effect of different mass ratio of mulberry and grape on the initial sugar contents and fermentation parameters of mulberry-grape compound fruit wine

2.1.2 不同桑椹和葡萄質量比對桑椹葡萄復合果酒感官品質的影響

不同桑椹和葡萄質量比對桑椹葡萄復合果酒感官品質的影響結果見圖1。由圖1可知，1號樣品色澤深紫，較澄清，桑椹香氣濃郁豐富，揮發酸高，愉悅度弱一些，感官評分為79分。2號樣品酒體澄清，有光澤，無沉淀，桑椹香氣濃郁豐富，感官評分為82分。3號樣品色澤深紫，較澄清，口感平衡，回味較好，感官評分為83分。4號樣品色澤深紫，比較澄清，口感爽凈，平衡協調，回味長，感官評分為90分。5號樣品色澤紫紅，澄清透明，桑椹香氣濃郁，口感單薄，回味短，感官評分為87分。6號樣品色澤紫紅，澄清晶亮入口時酸，掩蓋了一部分香氣成分，整體表現略有欠缺，余味短，感官評分為82分。因此，最適桑椹和葡萄質量比為1∶4。綜上，桑椹和葡萄質量比1∶4最適合釀制桑椹葡萄復合果酒。

圖1 不同桑椹和葡萄質量比對桑椹葡萄復合果酒感官評分的影響Fig.1 Effect of different mass ratio of mulberry and grape on sensory score of mulberry-grape compound fruit wine

2.1.3 桑椹葡萄復合果酒發酵工藝優化單因素試驗

在桑椹和葡萄質量比為1∶4條件下，分別設置酵母接種量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，發酵時間為3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，發酵溫度為17 ℃、20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃進行復合果酒發酵工藝優化單因素試驗，結果見圖2。

圖2 酵母接種量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）對桑椹葡萄復合果酒酒精度和感官評分的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum (A),fermentation temperature (B)and time (C) on the alcohol content and sensory score of mulberry-grape compound fruit wine

由圖2A可知，在接種量為1.0%～2.0%時，酒精度和感官評分隨之增高；在接種量為2%時，酒精度和感官評分最高，分別為13.2%vol和92分；在接種量為2.0%～3.0%時，酒精度和感官評分隨之下降。因此，最適接種量為2.0%。由圖2B可知，在發酵溫度為17～23 ℃時，酒精度和感官評分隨之增高；在發酵溫度為23 ℃時，酒精度和感官評分最高，分別為13.6%vol和92分；在發酵溫度為23～29 ℃時，酒精度和感官評分隨之下降。因此，最適發酵溫度為23 ℃。由圖2C可知，在發酵時間為3～9 d時，酒精度和感官評分隨之增高；在發酵時間為9 d時，酒精度和感官評定分數最高，分別為13.6%vol和92分；在發酵時間為9～13 d時，酒精度和感官評分隨之下降。因此，最適發酵時間為9 d。

2.2 桑椹葡萄復合果酒發酵工藝優化響應面試驗

2.2.1 響應面分析及模型方差分析

在單因素試驗基礎上，選取對桑椹葡萄復合果酒發酵影響較大的發酵溫度（A）、酵母接種量（B）、發酵時間（C）作為自變量，以酒精度（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，依據Box-Behnken試驗設計原理，設計17個試驗點的響應面分析試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表4，方差分析見表5。

表4 桑椹葡萄復合果酒發酵工藝優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of mulberry-grape compound fruit wine

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4數據進行二次回歸方程擬合，得到酒精度和感官評分對發酵溫度（A）、酵母接種量（B）及發酵時間（C）的多元二次回歸方程：

由表5可知，模型顯著（P＜0.001），酒精度失擬項不顯著（P=0.292 9＞0.05），感官評分失擬項不顯著（P=0.133 8＞0.05），表明該模型在研究區域擬合度較好。以酒精度為響應值，模型決定系數R2=0.955 8，調整決定系數R2Adj=0.899 0，以感官評分為響應值，模型決定系數R2=0.950 1，調整決定系數R2Adj=0.885 9，說明該回歸模型具有較好的擬合水平。由P值可知，一次項B，二次項A2、C2對酒精度影響極顯著（P＜0.01），一次項A、C，二次項B2對酒精度影響顯著（P＜0.05）；一次項B、C，二次項A2、C2對感官評分影響極顯著（P＜0.01），一次項A，二次項B2對感官評分影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，桑椹葡萄復合果酒中各因素對酒精度影響順序為酵母接種量＞發酵溫度＞發酵時間；各因素對感官評分影響順序為發酵時間=酵母接種量＞發酵溫度。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.2.2 驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6軟件分析，桑椹與葡萄質量比為1∶4時，最佳發酵工藝條件為：發酵溫度24.27 ℃、酵母接種量2.20%、發酵時間8.60 d。在此條件下，桑椹葡萄復合果酒的酒精度的理論值為13.63%vol，感官評分的理論值為93.59分。考慮到實際操作可行性，將最佳發酵工藝條件修正為：發酵溫度24 ℃、酵母接種量2.0%、發酵時間9 d，對桑椹葡萄復合果酒發酵工藝條件進行3次平行驗證試驗，測得優化后的酒精度實際值為13.60%vol，感官評分實際值為94分，與預測值相差不大，驗證結果與響應面試驗預測結果基本一致，說明優化工藝可行。

2.2.3 桑椹葡萄復合果酒中揮發性化合物種類及含量

通過固相微萃取（SPME）提取桑椹葡萄酒樣品中的香氣化合物，并通過GC-MS進行分析[23]，結果見表6。由表6可知，桑椹葡萄復合果酒共檢出50種揮發性化合物，包括醇類20種、酯類9種、酸類10種、醛類3種、酚類3種、酮類1種、醚類2種、烯烴類2種。酯類如乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異戊酯等具特有的水果香氣[29]；醇類如乙醇、苯乙醇、三辛醇等具有強烈的酒精味道和花香[30]；酸類如琥珀酸具有輕微的咸味和苦味[31]；醛類如苯乙醛具有能夠產生強烈的類似甜酒的風味[32]；萜烯化合物能產生類似香橙花和玫瑰花的香氣，有時候也會有鳳梨的香氣[33]。這些香氣成分共同構成了桑椹葡萄發酵酒獨特的香氣與風格。

表6 桑椹葡萄復合果酒的香氣成分測定結果及香氣特征Table 6 Determination results of aroma compounds and aroma characteristics of mulberry-grape compound fruit wine

續表

3 結論

釀造桑椹葡萄復合果酒的最佳桑椹葡萄質量比為1∶4。采用單因素試驗及響應面試驗確定最佳發酵工藝條件為：酵母接種量2.0%，發酵溫度24 ℃，發酵時間9 d。在此條件下，酒精度為13.6%vol，感官評分為90分。桑椹葡萄復合果酒共檢出50種香氣化合物，包括醇類20種、酯類9種、酸類10種、醛類3種、酚類3種、酮類1種、醚類2種、烯烴類2種。其中醇類、酯類和酸類是桑椹葡萄復合果酒的香氣成分。這款果酒的特點是色澤深紫色，果香穩定和諧，酒體醇厚，回味豐富。桑椹葡萄復合果酒的開發將滿足人們對口感、風味和保健的追求，為解決桑椹的貯藏問題和深加工提供可行的策略。