響應面法優化納豆芽孢桿菌產納豆激酶培養條件

潘冬梅，部麗群，楊傳倫，田杰偉，張心青，郭南南，冉新新，王紅霞，馬春峰，牟文杰，于帥帥

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股集團有限公司，山東 濱州 256500；3.京博農化科技有限公司，山東 濱州 256500）

納豆激酶（nattokianse，NK）是由納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）產生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶[1]，由日本學者須見洋行對傳統發酵食品納豆及其提取物作研究時發現的[2]。納豆激酶是目前最具有潛力的口服溶栓藥物[3]，體內溶栓試驗表明，納豆激酶能減緩血栓的形成時間，明顯提高血栓的再通率和減少肺內血栓的形成[4]，且溶栓效果顯著高于同等劑量的尿激酶[5]。體外溶栓試驗表明，納豆激酶能使纖溶酶原激活物抑制劑（plasminogen adivator inhibitor，PAI）失活，從而將血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶，通過蛋白水解作用直接溶解纖維蛋白凝塊[6]，沒有任何毒副作用，這一點不同于市面常用藥物組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶、鏈激酶[7]。納豆激酶因具有高效的溶纖活性、安全性好[8]、生產成本低[9]、無毒副作用[10]、半衰期長[11]、在胃腸的穩定性好等優點[12]，而被廣泛關注。

傳統上，納豆激酶均是經過固態發酵獲得；目前，商業化應用的固態發酵工藝的納豆激酶活性一般能達到20～100 FU/g[13]。由于這種方法的產率低、勞動強度大，已經很少使用。現在普遍采用的是液體發酵法。納豆芽孢桿菌的發酵過程較為復雜，優化其培養條件對納豆激酶工藝開發、性能改善和工業化應用發揮至關重要的作用[14]。熊曉輝等[15]對納豆激酶的深層液體發酵條件進行了優化，得到的發酵液酶活為700 IU/mL；董明盛等[16]篩選出菌株NK-5，對其進行了培養條件的優化，發酵液酶活力達683.3 U/mL；田秀媛等[17]利用Plackett-Burman試驗設計對納豆芽孢桿菌的培養條件進行優化，得到的最佳種齡為8.5 h；KWON E Y等[18-19]都對納豆芽孢桿菌的液態發酵產酶條件進行了優化，而且酶活力也有較大提高。雖然納豆芽孢桿菌的產酶活力提高了很多，但納豆激酶總體產率較低、成本較高限制了其廣泛使用。

大量試驗表明，響應面分析方法在優化培養基[20]、優化培養條件方面是非常高效的工具[21-22]，響應面分析方法能用較少的試驗次數針對影響試驗目的的主要因素建立數學回歸模型[23]，并對模型進行方差、顯著性分析，確定各因素之間的交互關系，找出響應值最高對應研究因素的最佳取值。本研究以實驗室分離的一株高產納豆激酶的納豆芽孢桿菌為研究對象，在前期培養基優化基礎上。先利用單因素試驗優化納豆芽孢桿菌產納豆激酶培養條件，再利用響應面試驗對培養條件進行優化，以進一步提高納豆激酶活力，為納豆激酶產品的成本降低、廣泛使用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）：本實驗室篩選保藏。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、甘油、無水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、L-甲硫氨酸：國藥集團化學試劑有限公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

種子培養基[24]：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵培養基：甘油43 g/L，豆粕粉24 g/L，無水氯化鈣0.14 g/L，七水硫酸鎂0.80 g/L，十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L，無水磷酸二氫鉀1.00 g/L，L-甲硫氨酸0.20 g/L，pH 7.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BX-240H電子天平：日本島津公司；PHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1D型超凈工作臺：蘇州蘇凈凈化有限公司；HZQ-X100型振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機：科大創新有限公司中佳分公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌種子液及發酵液的制備

種子液的制備：挑取1環納豆芽孢桿菌菌株的新鮮斜面接種于裝液量為100 mL/500 mL的種子培養基中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養24 h（OD600nm值=1.5～1.6）。

發酵液的制備：將菌齡為24 h的種子液，按接種量5%（V/V）接種于裝液量為100 mL/500 mL的發酵培養基中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養96 h后，得到發酵液。

1.3.2 納豆激酶活力的測定

發酵液10 000 r/min離心10 min后，取上清液，采用紫外分光光度法[25]測定納豆激酶活力。

納豆激酶酶活力的定義：每分鐘波長275 nm 處吸光度值增加0.01 所需要的酶量定義為1個酶活力單位（FU/mL）。

1.3.3 納豆芽孢桿菌產納豆激酶培養條件優化

（1）單因素試驗

采用單因素輪換法依次考察培養溫度（27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃）、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、培養時間（72 h、84 h、96 h、108 h、120 h）及菌齡（12 h、18 h、24 h、30 h、36 h）對納豆激酶活力的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，進行響應面優化試驗。根據Box-Behnken設計原理，以培養溫度（A）、培養基初始pH（B）、接種量（C）、培養時間（D）、菌齡（E）為自變量，納豆激酶活力（Y）為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行5因素3水平的響應面分析試驗，共分46個試驗單元。其中40個為析因子，6個為中心重復試驗以估計誤差。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 培養條件優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for culture conditions optimization

2 結果與分析

2.1 培養條件優化單因素試驗

2.1.1 培養溫度的選擇

不同培養溫度對納豆芽孢桿菌產納豆激酶活力的影響見圖1。由圖1可知，當培養溫度為27～33 ℃時，納豆激酶活力隨溫度升高而增大；當培養溫度為33 ℃時，納豆激酶活力最高，為4 531 FU/mL；當培養溫度為33～39 ℃時，納豆激酶活力有所下降。培養溫度由27 ℃升到33 ℃，納豆激酶活力逐漸升高，可見適溫可提高菌體的活性；培養溫度由33 ℃升到39 ℃，納豆激酶活力逐漸降低，可能高溫促進了菌體的衰亡，影響了納豆激酶的產量。因此，最適培養溫度為33 ℃。

圖1 不同培養溫度對納豆激酶活力的影響Fig.1 Effect of different culture temperature on nattokinase activity

2.1.2 培養基初始pH的選擇

不同培養基初始pH值對納豆芽孢桿菌產納豆激酶活力的影響見圖2。

圖2 不同培養基初始pH對納豆激酶活力的影響Fig.2 Effect of different medium initial pH on nattokinase activity

由圖2可知，當培養基初始pH為6.0～7.5時，納豆激酶活力隨培養基初始pH升高而增大；當培養基初始pH為7.5時，納豆激酶活力最高，為4 556 FU/mL；當培養基初始pH為7.5～8.0時，納豆激酶活力有所下降。pH偏低或偏高都不利于納豆激酶的合成。因此，最適培養基初始pH值為7.5。

2.1.3 接種量的選擇

不同接種量對納豆芽孢桿菌產納豆激酶活力的影響見圖3。

圖3 不同接種量對納豆激酶活力的影響Fig.3 Effect of different inoculum on nattokinase activity

由圖3可知，當接種量為1%～3%時，納豆激酶活力隨接種量升高而增大；當接種量為3%時，納豆激酶活力最高，為4 627 FU/mL；當接種量為3%～9%時，納豆激酶活力有所下降。接種量偏小影響菌體的生長、接種量偏大影響物質的過快消耗，都阻礙了納豆激酶的產生。因此，最適接種量為3%。

2.1.4 培養時間的選擇

不同培養時間對納豆芽孢桿菌產納豆激酶活力的影響見圖4。

圖4 不同培養時間對納豆激酶活力的影響Fig.4 Effect of different culture time on nattokinase activity

由圖4可知，當培養時間為72～96 h時，納豆激酶活力隨培養時間延長而增大；當培養時間為96 h時，納豆激酶活力最高，為4 792 FU/mL；當培養時間為96～120 h時，納豆激酶活力有所下降。發酵時間過短有部分產物還沒有分泌完全，發酵時長偏長又可能導致納豆激酶作為營養被菌體利用，都達不到生產的最大效益化。因此，最適培養時間為96 h。

2.1.5 菌齡的選擇

不同菌齡對納豆芽孢桿菌產納豆激酶活力的影響見圖5。

圖5 不同菌齡對納豆激酶活力的影響Fig.5 Effect of different cell age on nattokinase activity

由圖5可知，當菌齡為12～18 h時，納豆激酶活力隨菌齡升高而增大；當菌齡為18 h時，納豆激酶活力最高為5 069 FU/mL，種子液在對數期轉接發酵瓶，菌種活力最強，遲緩期和衰亡期轉種都不能使菌種的生理代謝最活躍；當菌齡為18～36 h時，納豆激酶活力有所下降。因此，最適菌齡為18 h。

2.2 培養條件優化響應面試驗

2.2.1 Box-Benhnken試驗結果與分析

Box-Benhnken試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 培養條件優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for culture conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對Box-Benhnken試驗結果進行響應面分析，得到納豆激酶活力（Y）對培養溫度（A）、培養基初始pH（B）、接種量（C）、培養時間（D）、菌齡（E）的多元二次回歸方程如下：

由表3可知，模型P值＜0.000 1，模型極顯著，失擬項P值0.054 1＞0.05，失擬項不顯著，表明模型擬合性良好。模型決定系數R2=0.979 1，調整決定系數R2Adj=0.962 4，說明有97.91%的數據都可用該方程進行解釋，具有較高相關性，模型試驗誤差合理。由P值可知，一次項A、B、C、D、E，二次項A2、B2、C2、D2、E2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對結果影響顯著（P＜0.05），其他交互項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，5個因素對納豆激酶活力影響由大到小順序為：培養溫度（A）＞菌齡（E）＞培養時間（D）＞接種量（C）＞培養基初始pH（B）。

利用Design-Expert 8.0.6軟件根據多元二次回歸方程繪制培養溫度（A）和培養基初始pH（B）間交互作用的三維響應面及等高線，結果見圖6。

圖6 培養溫度與培養基初始pH間交互作用對納豆激酶活力影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between culture temperature and culture medium initial pH on nattokinase activity

由圖6可知，納豆激酶活力隨著培養溫度（A）和培養基初始pH（B）兩者均呈現先增加后減少的趨勢，A、B間交互作用響應面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，表明二者間交互作用對納豆激酶活力的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.2 模型驗證

根據二次回歸方程得到納豆激酶優化后的培養條件為：培養溫度33.66 ℃、培養基初始pH 7.47、接種量2.86%、培養時間95.15 h、菌齡17.51 h。在此條件下，納豆激酶活力預測值為5 079 FU/mL。為了方便實際操作，將培養條件修正為：培養溫度34 ℃、培養基初始pH 7.5、接種量3%、培養時間95 h、菌齡17.5 h。在此條件下進行3次平行驗證試驗，納豆激酶活力分別為5 092 FU/mL、5 083 FU/mL、5 087 FU/mL，平均實際值為5 087 FU/mL，與預測值基本一致，納豆激酶活力較優化前提高了18.83%。

3 結論

本研究取影響納豆激酶活力的5個重要條件因子，在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，設計5因素3水平的響應面試驗，得出納豆激酶的最佳培養條件為：培養溫度34 ℃、發酵培養基初始pH值7.5、接種量3%、培養時間95 h、菌齡17.50 h。在此最佳培養條件下，納豆激酶活力達到5 087 FU/mL，較優化前提高18.83%。