基于響應(yīng)面法優(yōu)化高產(chǎn)乙酸乙酯大曲清香型白酒二米查酒醅恒溫發(fā)酵工藝

甄 攀，高文靜，李惠源，王軍燕，韓 英，賈麗艷

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 呂梁 032209；2.山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

大曲清香型白酒具有清亮透明，清香純正，陳香糧香，醇厚綿甜的特點(diǎn)[1-2]，是以粳高粱為原料，谷糠、稻殼為輔料，大曲為糖化發(fā)酵劑，通過(guò)“清蒸二次清，地缸固態(tài)發(fā)酵，甑桶蒸餾”工藝生產(chǎn)而成的。微生物是白酒發(fā)酵的核心，也是影響白酒中風(fēng)味物質(zhì)形成的重要因素[3-4]。在各種微生物的共同作用下，通過(guò)開(kāi)放式固態(tài)“雙邊效應(yīng)”的發(fā)酵方式，邊糖化邊發(fā)酵[5-6]。

有研究表明，清香型白酒最重要的氣味特征是果香、甜香和花香，而這些香氣主要由酯類物質(zhì)所提供，其中包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等酯類物質(zhì)[7]。乙酸乙酯作為大曲清香白酒的核心風(fēng)味物質(zhì)之一，在形成大曲清香型白酒獨(dú)特的風(fēng)味特征上具有重要的貢獻(xiàn)[8-9]。近年來(lái)，武金玲等[10]對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的配料比、窖泥乙酸菌活性、大曲貯存時(shí)間等條件進(jìn)行改進(jìn)，增加了濃香型白酒中的乙酸乙酯含量，優(yōu)質(zhì)品率提升8.5%；宋瑞濱等[11]在濃香白酒機(jī)械化、自動(dòng)化和智能化釀造生產(chǎn)條件下，從出池、入池、摘酒工藝進(jìn)行改進(jìn)，降低了白酒中乙酸乙酯的含量。

目前，大曲清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中采用的是開(kāi)放式發(fā)酵方式，使得外界環(huán)境（如發(fā)酵溫度）對(duì)酒醅中乙酸乙酯的形成有一定的影響，從而影響大曲清香型白酒酒質(zhì)[12-15]。研究恒溫條件下，大曲清香型白酒的最佳生產(chǎn)工藝對(duì)于清香型白酒可控發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義[16-17]。因此，本研究以大曲清香型白酒大米查酒糟為底物，在恒溫條件下進(jìn)行二米查酒醅發(fā)酵。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量影響顯著的環(huán)境因子，并結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化大曲清香型白酒二米查恒溫發(fā)酵條件，以提高大曲清香型白酒中乙酸乙酯含量，使白酒更加柔和爽凈，優(yōu)化其口感風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大米查酒糟（經(jīng)過(guò)一次摘酒后的酒糟）、低溫大曲（清茬曲、紅心曲、后火曲的混合生產(chǎn)用曲）、谷糠、稻殼：山西某酒廠。

1.1.2 試劑

乙腈、乙酸乙酯（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市風(fēng)和化學(xué)試劑科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；85-2A磁力攪拌器：精鑿科技（上海）有限公司；ST2100 pH計(jì)：常州奧豪斯儀器有限公司；SCAA-104有機(jī)相尼龍針式濾器：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲清香型白酒二米查酒醅的恒溫發(fā)酵工藝[18]

取大米查酒糟（水分添加量50%），待其冷卻至室溫后，拌入紅糝（高梁粉碎后的原糧）干質(zhì)量9%的輔料（谷糠∶稻殼=1∶1，高溫蒸煮30 min），再拌入紅糝干質(zhì)量10%的大曲，28 ℃恒溫發(fā)酵28 d。

1.3.2 大曲清香型白酒二米查酒醅恒溫發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以大曲清香型白酒大米查酒糟為發(fā)酵底物，二米查酒醅中乙酸乙酯含量和酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察發(fā)酵時(shí)間（0、3 d、7 d、15 d、17 d、21 d、24 d、28 d）、發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、大曲添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%）、輔料添加量（3%、6%、9%、12%、15%、18%）和水分添加量（10%、30%、50%、70%、90%、110%）對(duì)大曲清香型白酒二米查酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定影響大曲清香型白酒二米查酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的顯著因素。以酒醅中乙酸乙酯含量為響應(yīng)值，以大曲添加量（A）、輔料添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）及水分添加量（D）為考察因素，采用Design-Expert 12軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 大曲清香型白酒二米查酒醅恒溫發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for constant temperature fermentation process optimization of Ercha fermented grains of Daqu light-flavor Baijiu

1.3.3 分析檢測(cè)

乙酸乙酯含量的測(cè)定：參考魏志陽(yáng)等[19]的高效液相色譜法，略加修改。HPLC條件：ZORBAXSB-C18色譜柱（4.6mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

酒精度的測(cè)定：參考國(guó)標(biāo)GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》[20]中的酒精計(jì)法。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

利用Design Expert 12軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)；利用Origin Pro2021軟件繪制單因素分析圖；采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲清香型白酒二米查酒醅發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒醅中乙酸乙酯含量呈先升高后下降的趨勢(shì)，酒精度呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，分析原因可能是發(fā)酵初期酒醅中產(chǎn)酯酵母生長(zhǎng)代謝旺盛，產(chǎn)酯速率較高，發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，乙醇含量增加，合成乙酸乙酯逆反應(yīng)加速[21-22]，因此酯類物質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為21 d時(shí)，乙酸乙酯含量最高，為（0.46±0.02）g/kg，酒精度為（8.00±0.20）%vol；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為17 d時(shí)，酒醅中酒精度最高，為（8.10±0.25）%vol，而此時(shí)乙酸乙酯的含量為（0.44±0.02）g/kg。綜合考慮，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為21 d。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響

傳統(tǒng)大曲清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵酒醅受微生物代謝及外界保溫散熱條件的影響，酒醅中乙酸乙酯含量隨溫度的改變，發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[23-24]。發(fā)酵溫度對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量均呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，酒醅中乙酸乙酯的含量最高，為（0.52±0.01）g/kg，酒精度為（8.10±0.2）%vol；當(dāng)發(fā)酵溫度為26 ℃時(shí)，酒醅中的酒精度最高，為（8.30±0.15）%vol，乙酸乙酯含量為（0.48±0.02）g/kg。綜合考慮，確定最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.2 Effect of fermentation temperatures on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain

2.1.3 大曲添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響

大曲作為白酒發(fā)酵過(guò)程中主要的微生物來(lái)源，是傳統(tǒng)清香白酒的糖化發(fā)酵劑[25]。大曲添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著大曲添加量的增加，酒醅中乙酸乙酯的含量及酒精度先增高后趨于穩(wěn)定，分析原因可能是因?yàn)榇笄砑恿康脑黾樱岣吡烁吡辉系睦寐剩矸鄞罅哭D(zhuǎn)化為乙醇、乙酸，進(jìn)而合成乙酸乙酯。但是二米查酒醅中淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一定，隨著大曲添加量的增加，酒醅中微生物作用逐漸緩慢，合成乙酸乙酯減少。當(dāng)酒醅中大曲添加量為12%時(shí)，酒醅中乙酸乙酯含量最高達(dá)到（0.51±0.02）g/kg，酒精度最高達(dá)到（9.20±0.10）%vol。故綜合考慮，確定最佳大曲添加量為12%。

圖3 大曲添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.3 Effect of Daqu addition on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain

2.1.4 輔料添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響

大曲清香型白酒大米查發(fā)酵為純糧發(fā)酵，二米查發(fā)酵為純槽發(fā)酵[18]。二米查發(fā)酵添加一定量的輔料有助于酒醅中產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯，促進(jìn)酒醅中乙酸乙酯的合成[26]。輔料一般采用質(zhì)量比為1∶1混合的谷糠和稻殼，提前24 h高溫蒸30 min，以減少輔料中單寧物質(zhì)及輔料本身的谷糠味對(duì)大曲清香型白酒品質(zhì)的影響[26-27]。輔料添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著輔料添加量的增加，酒醅中的乙酸乙酯含量及酒精度均呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是輔料添加過(guò)多酒醅中淀粉含量降低，透氣性增加，二米查酒醅中乙醇的生成變緩，不利于乙酸乙酯的合成[26]。當(dāng)輔料添加量為9%時(shí)，酒醅中乙酸乙酯含量達(dá)到最高，為（0.54±0.01）g/kg，酒精度為（7.90±0.10）%vol；當(dāng)輔料添加量為6%時(shí)，酒醅中酒精度達(dá)到最高，為（8.05±0.25）%vol，此時(shí)，酒醅中乙酸乙酯含量為（0.48±0.01）g/kg。綜合考慮，確定最佳輔料添加量為9%。

圖4 輔料添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.4 Effect of auxiliary material additions on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain

2.1.5 水分添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響

物料的入缸水分添加量會(huì)影響酒醅的發(fā)酵程度和白酒中風(fēng)味物質(zhì)，通過(guò)在蒸煮物料時(shí)控制水分添加量，進(jìn)而控制物料的入缸水分。水分添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著水分添加量的逐漸升高，乙酸乙酯和酒精度均呈先升高后降低的趨勢(shì)，分析原因可能是入缸水分增加導(dǎo)致淀粉轉(zhuǎn)化為乙酸，酒醅中酸度增加，乙酸乙酯合成逆反應(yīng)加速，乙酸乙酯增加緩慢[28-29]。當(dāng)水分添加量為50%時(shí)，酒醅中的乙酸乙酯含量及酒精度均達(dá)到最高，分別為（0.57±0.02）g/kg、（8.55±0.25）%vol。綜合考慮，確定最佳水分添加量為50%。

圖5 水分添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.5 Effect of water addition on ethyl acetate content and alcohol content in fermented grain

2.2 大曲清香型白酒二米查酒醅發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出4個(gè)影響酒醅中乙酸乙酯含量的顯著因子，以乙酸乙酯含量（Y）為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步確定大曲清香型白酒二米查高產(chǎn)乙酸乙酯恒溫發(fā)酵工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 大曲清香型白酒二米查酒醅發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for constant temperature fermentation process optimization of Ercha fermented grains of Daqu light-flavor Baijiu

續(xù)表

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用DesignExpert12軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到酒醅中乙酸乙酯含量（Y）對(duì)大曲添加量（A）、輔料添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）及水分添加量（D）的二次回歸方程為：Y=-13.244 35+0.497 938A-0.164 833B-0.728 972C-0.003 047D+0.000 833AB+0.001 250AC+0.000 031AD+0.001 667BC+0.000 083BD+0.000 042CD-0.022 375A2-0.012 722B2-0.013 694C2-0.000 060D2。

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P=0.378 2＞0.05，不顯著，表明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好，回歸方程決定系數(shù)R2為0.997 3，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.994 6。說(shuō)明乙酸乙酯的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間的擬合度較高[30]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。由表4亦可知，一次項(xiàng)A、B、C、D、交互項(xiàng)BC、BD和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 各因素間交互作用的響應(yīng)面分析

大曲添加量（A）、輔料添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、水分添加量（D）四因素間交互作用對(duì)大曲清香型白酒二米查酒醅中乙酸乙酯含量（Y）影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

圖6 大曲添加量、輔料添加量、發(fā)酵溫度和水分添加量間交互作用對(duì)乙酸乙酯含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between Daqu addition,auxiliary material addition,fermentation temperature and water addition on ethyl acetate contents

由圖6可知，各因素間交互作用對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量影響的響應(yīng)曲面呈凸?fàn)睿嬖谧罡咧担渲薪换ロ?xiàng)AC、BC、BD對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)曲面較陡，等高線呈橢圓形，說(shuō)明AC、BC、BD之間存在交互作用，對(duì)乙酸乙酯含量的影響顯著（P＜0.05），與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 12軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型進(jìn)行最優(yōu)求解，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為大曲添加量12.10%，輔料添加量8.84%，發(fā)酵溫度27.76 ℃，水分添加量44.44%，在此條件下，模型預(yù)測(cè)得到的乙酸乙酯含量為0.68 g/kg。為便于實(shí)際操作，將最優(yōu)條件修正為輔料添加量8.8%，大曲添加量12%，發(fā)酵溫度28 ℃，水分添加量44%，在此發(fā)酵工藝條件下，做3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得酒醅中乙酸乙酯含量實(shí)際值為（0.69±0.01）g/kg，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明此工藝條件可靠，可用于對(duì)大曲清香型白酒二米查恒溫發(fā)酵最佳環(huán)境條件下乙酸乙酯含量的預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

以傳統(tǒng)大曲清香白酒大米查酒糟為發(fā)酵底物，以乙酸乙酯含量及酒精度為考察指標(biāo)，采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到大曲清香白酒二米查酒醅的最優(yōu)恒溫發(fā)酵工藝條件為大曲添加量12%、輔料添加量8.8%、水分添加量為44%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間21 d，在此優(yōu)化條件下，酒醅中乙酸乙酯含量達(dá)到最高，為（0.69±0.01）g/kg，比優(yōu)化前（0.392 g/kg）提高了76.9%。本研究為大曲清香型白酒恒溫機(jī)械化、智能化發(fā)酵提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。