響應面法優化煙草發酵培養基提高細菌纖維素產量

胡仙妹，張 晨，楊雪鵬，張 展，尹獻忠

（1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業有限公司，河南 鄭州 450016）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種由β-1,4葡萄糖苷鍵連接而成的生物高分子聚合物。BC與植物纖維結構相似，因其具有高純度、高聚合度、高結晶度、高持水性、高抗張強度和生物相容性好等特點[1]，已被廣泛應用于食品[2-3]、造紙[4]、生物醫藥[5-6]和紡織品[7-8]等領域。常見的細菌纖維素發酵菌屬有醋酸菌屬（Acetobacter）[9]、根瘤菌屬（Rhizobium）[10]和土壤桿菌屬（Agrobacterium）[11]等。目前，已有大量文獻采用優良菌株選育[12-14]、發酵工藝優化[15]、生物合成調控[16]等方法來提高細菌纖維素產量，但細菌纖維素產量仍然偏低，生產成本較高，難以滿足工業化生產的要求，而靜態培養法有培養方法簡單、產品性能優異、產品形狀可控等優點，是細菌纖維素制備的首選方法[17]。

我國的煙葉種植面積超過100萬hm2，年均產生的煙草廢棄物（低次煙葉、莖稈、杈煙等）多達400萬t[18]，其處理方式大多為隨意丟棄或者集中焚燒銷毀，造成了較大的環境污染和資源浪費[19]。因此，開發利用廢棄煙末進行細菌纖維素生產，對其培養基組分及發酵條件進行優化是提高細菌纖維素產量、降低生產成本的有效途徑[20]。張婷婷等[21]開發了利用廢棄煙末發酵制備細菌纖維素的技術，并對接種量、溫度、pH和發酵時間等條件進行優化。由煙草廢棄物制備細菌纖維素雖然已經實現，但煙草原料中煙堿等物質對菌體生長及BC合成有一定的抑制作用，使其產量較低，煙草廢棄物的利用率僅為2%左右。因此，提高煙草廢棄物的利用率，對環境保護具有重要意義。

本研究以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為試驗菌株，采用靜態發酵的方式，對煙草廢棄物進行發酵制備細菌纖維素，通過單因素試驗和Box-Behnken試驗對煙草發酵培養基組分進行優化，以期提高細菌纖維素產量，為后續細菌纖維素的放大生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）ATCC 23767：由鄭州輕工業大學食品與生物工程學院生物催化與轉化實驗室保藏；煙末廢棄物：由貴州中煙工業有限公司提供。

1.1.2 試劑

酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；無水葡萄糖（分析純）：天津市致遠化學試劑有限責任公司；無水乙醇、乳酸（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限責任公司；蛋白胨（生化試劑）、水楊酸、草酸、蘋果酸、延胡索酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、硫酸銨、硝酸銨、檸檬酸（均為分析純）：天津市登科化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

種子培養基：葡萄糖70 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L，115 ℃滅菌20 min，冷卻后添加1%（V/V）無水乙醇。

煙草發酵培養基：煙末100 g，以固液比為1∶10（g∶mL）加水，60 ℃浸提1.5 h后過濾，取濾液，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-ID超凈工作臺：蘇州凈化有限公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；GR85DA高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；ZQWY-200S臥式全溫振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；SHP-150生化培養箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌纖維素的制備

從-80 ℃冰箱中取保藏的菌液100 μL，接種至裝液量為50 mL/250 mL的種子培養基中，于30 ℃、200 r/min條件下培養24 h，制成種子液。將種子液以10%（V/V）的接種量接種于裝液量為150 mL/500 mL的煙草發酵培養基中，30 ℃恒溫靜置培養7 d后即可制得細菌纖維素膜。

1.3.2 細菌纖維素的純化處理

將靜置發酵7 d后獲得的BC膜取出，浸泡至0.1 mol/L的NaOH溶液中，于沸水浴加熱1 h，以除去殘留在纖維素膜表面的菌體及發酵液，然后用蒸餾水反復洗滌至BC膜至中性。經過純化處理的BC用于產量測定及持水性能分析。

1.3.3 發酵培養基組分優化單因素試驗

以細菌纖維素產量為評價指標，分別選擇培養基的氮源種類（蛋白胨、酵母粉、硫酸銨和硝酸銨）及氮源添加量（0、1 g/L、2 g/L、3 g/L和4 g/L）、乙醇體積分數（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%和4.0%）、有機酸種類（檸檬酸、水楊酸、草酸、蘋果酸、延胡索酸、乳酸）及有機酸添加量（0、0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L和1.25 g/L）進行單因素試驗優化。培養基組分優化單因素試驗中，所有試驗因素空白組均為未添加該因素的煙草發酵培養基，試驗組為添加該因素的煙草發酵培養基。

1.3.4 發酵培養基組分優化Box-Behnken試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇硫酸銨添加量（A）、乙醇體積分數（B）和蘋果酸添加量（C）3個對細菌纖維素產量影響明顯的因素為自變量，以細菌纖維素產量（Y）為響應值，采用Design Expert 10.0.8軟件設計3因素3水平的Box-Behnken試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 培養基組分優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box Behnken tests for medium components optimization

1.3.5 細菌纖維素產量計算及持水性能的測定

純化處理后的BC膜經4 000 r/min離心20 min，定義為濕膜，記為W濕；將80℃下烘干至恒質量的細菌纖維素膜定義為干膜，記為W干；在常溫環境下將干膜浸入去離子水中，浸泡48h后用濾紙吸干表面水分，所得膜定義為復水膜，記為W復。

按公式（1）計算BC的產量，分別按公式（2）～（4）計算BC的含水率、復水率和溶脹率。

式中：R為細菌纖維素產量，g/L；V為發酵液體積，L；C1為濕膜含水率，%；C2為干膜復水率，%；C3為溶脹率，%。

1.3.6 數據處理

所有試驗均重復3次，數據采用SPSS19.0和Origin2019進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基組分優化單因素試驗結果

2.1.1 氮源種類及添加量對細菌纖維素產量的影響

氮源是菌體合成蛋白質、氨基酸及核酸等含氮物質的來源。菌株發酵生產細菌纖維素的過程中，充足的氮源不僅能夠為菌體生長提供氮元素，還能夠作為細菌纖維素合成相關酶的輔助因子[22]。本試驗考察了外源添加蛋白胨、酵母粉、硫酸銨和硝酸銨4種氮源對細菌纖維素產量的影響，氮源種類及添加量對細菌纖維素產量的影響見圖1。

圖1 氮源種類（A）及硫酸銨添加量（B）對細菌纖維素產量的影響Fig.1 Effect of nitrogen sources (A) and ammonium sulfate addition(B) on bacterial cellulose production

由圖1A可知，硫酸銨對細菌纖維素的產量提升效果最明顯，細菌纖維素產量為16.09g/L。因此，選擇硫酸銨為最佳氮源。由圖1B可知，隨著硫酸銨添加量在0～3 g/L范圍內不斷增加，細菌纖維素產量逐漸上升；當硫酸銨添加量達到3 g/L時，細菌纖維素產量最高，為23.44 g/L；隨著硫酸銨添加量在3～4 g/L范圍繼續增加，細菌纖維素產量降低。因此，選擇硫酸銨的最適添加量為3 g/L。

2.1.2 乙醇體積分數對細菌纖維素產量的影響

在添加乙醇的情況下，乙醇作為額外碳源，會使微生物對葡萄糖的消耗減少，使得更多的葡萄糖可以用于BC的合成[23]，從而提高BC的產量。許燕娜等[24]認為，木醋桿菌可以將乙醇轉化為乙酸，再將乙酸分解為二氧化碳和水，從而提高三磷酸腺苷水平，進而提高細菌纖維素的產量。乙醇體積分數對細菌纖維素產量的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對細菌纖維素產量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on bacterial cellulose production

由圖2可知，隨著乙醇體積分數在0～2%范圍內的增加，細菌纖維素產量逐漸增加；當乙醇體積分數為2%時，細菌纖維素產量達到最大值，達到20.58 g/L，促進效果較為明顯；但當乙醇體積分數繼續增加，細菌纖維素產量降低。因此，選擇最佳乙醇體積分數為2%。

2.1.3 有機酸種類及添加量對細菌纖維素產量的影響

有機酸種類及添加量對細菌纖維素產量的影響見圖3。

圖3 有機酸種類（A）及蘋果酸添加量（B）對細菌纖維素產量的影響Fig.3 Effect of types of organic acids (A) and malic acid addition (B)on bacterial cellulose production

由圖3A可知，添加有機酸類物質對木醋桿菌生產BC都有促進作用，其中蘋果酸促進作用最強，其BC產量為17.79 g/L。賈青慧等[25]研究發現，發酵過程中葡萄糖酸和乙酸在一定范圍內有利于木醋桿菌合成BC；錢子俊等[26]研究發現，檸檬酸對BC產量具有一定促進作用；李玨等[27]研究發現，乙酸代替檸檬酸作為有機酸成分加入發酵培養基時，可提高BC合成量。可見，有機酸是BC合成過程中常見的發酵促進因子，但由于菌種等不同，各種有機酸的效果存在較大差異。由圖3B可知，隨著蘋果酸添加量在0～0.5 g/L范圍內增加，細菌纖維素產量逐漸增加；當蘋果酸添加量為0.5 g/L時，細菌纖維素產量達到最高值，為19.98 g/L；當蘋果酸添加量＞0.5 g/L，細菌纖維素產量逐漸下降。BC的合成過程中需要大量能量，有機酸類物質可通過氧化生成丙酮酸，參與細胞代謝并產生能量，較多的能量可以促進BC的合成[28]。隨著蘋果酸添加量持續增加，反饋抑制增強，菌體的生長受到抑制，使細菌纖維素產量有所降低[29]。

2.2 發酵培養基組分優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗結果的基礎上，以細菌纖維素產量（Y）為響應值，以對細菌纖維素產量有明顯影響的3個因素硫酸銨添加量（X1）、乙醇體積分數（X2）和蘋果酸添加量（X3）為自變量，采用Design Expert 10.0.8軟件進行Box-Behnken試驗，試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 培養基組分優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box Behnken tests for medium component optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

運用Design Expert 10.0.8軟件對表2的數據進行二次多項擬合，得到響應值與各因素之間的回歸方程：Y=33.86+1.21X1+0.29X2+0.22X3+0.18X1X2+0.07X1X3-0.005X2X3-2.61X12-2.73X22-1.92X32

由表3可知，回歸模型極顯著（P＜0.01）；失擬項不顯著（P值=0.7＞0.05），表明該模型具有較高可靠性，與實際情況擬合程度良好。該模型的決定系數R2=0.993 0，調整決定系數R2Adj=0.993 0，表明此模型方程是可靠的，用該方程進行分析和預測，預測值與實際測定值之間相關性較高。由表3亦可知，一次項X1、X2和二次項X12、X22和X32均對細菌纖維素產量有極顯著影響（P＜0.01），一次項X3對細菌纖維素產量有顯著影響（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對細菌纖維素產量影響強弱順序依次為X1（硫酸銨添加量）＞X2（乙醇體積分數）＞X3（蘋果酸添加量）。

2.2.2 驗證試驗

通過Design Expert 10.0.8軟件得到煙草發酵培養基組分的最佳配方為：硫酸銨添加量3.234 g/L，乙醇體積分數2.030%，蘋果酸添加量0.515 g/L。在此優化條件下，細菌纖維素產量理論值為33.83 g/L。在實際發酵過程中，考慮到實際操作可行性，將煙草發酵培養基組分的最佳配方調整為：硫酸銨添加量3.2 g/L，乙醇體積分數2.0%，蘋果酸添加量0.5 g/L。在此最優發酵培養基組合下進行3次平行試驗，細菌纖維素產量實際值為32.27 g/L，實際值與理論值差異不大，充分證明該模型的準確性與實用性，細菌纖維素產量是優化前的2.74倍。

2.3 細菌纖維素的持水性能測定結果

細菌纖維素的持水性能經常用含水率和復水率來表示[30]，將煙草發酵培養基優化前后的細菌纖維素進行持水性能測定，其含水率、復水率和溶脹率結果見表4。

表4 培養基優化前后細菌纖維素的持水性能測定結果Table 4 Determination results of water holding capacity of bacterial cellulose before and after medium optimization

由表4可知，與優化前培養基相比，優化后培養基的細菌纖維素含水率（94.35%）相差不大，但復水率（40.30%）和溶脹率（673.56%）分別增加了8%和2%。

3 結論

以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為試驗菌株，靜態發酵煙草廢棄物制備細菌纖維素，最佳煙草發酵培養基配方為：硫酸銨添加量3.2 g/L，蘋果酸添加量0.5 g/L，體積分數2%的乙醇。在此最佳條件下，細菌纖維素的產量為32.27 g/L，是優化前煙草發酵培養基的2.74倍。優化后煙草發酵培養基制備的細菌纖維素含水率為94.35%，其復水率和溶脹率分別為40.30%和673.56%，與優化前培養基的細菌纖維素相比，含水率相差不大，而復水率和溶脹率均有所增加。