依達拉奉抑制線粒體分裂減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

張 寧，丁澤君，于海達，李鳳曉

(1.青島市市立醫院 麻醉科，山東 青島266011；2.青島大學附屬醫院 藥學部，山東 青島266000)

依達拉奉具有神經保護作用，能夠抗氧化和清除自由基,抑制神經元氧化損傷，對抗神經細胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷[1-2]，廣泛應用于臨床缺血性腦血管病的治療中。

線粒體是細胞生命活動中重要的細胞器，是細胞凋亡的調控中心，在生理狀態下，線粒體通過分裂與融合活動來維持相對穩定的形態和正常細胞功能，如能量代謝、發育、細胞凋亡等。在缺血再灌注損傷過程中，線粒體分裂與融合動態平衡被改變，線粒體分裂增加能夠促進細胞凋亡[3-4]。本研究旨在觀察依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與線粒體分裂的關系，進一步探討依達拉奉在腦缺血再灌注損傷中的保護機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠90只，3月齡，體重250～300 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號：SCXK(魯)2014-0007。大鼠適應性飼養1周，隨機分為假手術組(S組)、腦缺血再灌注組(I/R組)和依達拉奉預先給藥組(E組)，每組30只。E組于腦缺血前1 h腹腔注射依達拉奉(批號：141109，昆明積大制藥有限公司) 10 mg/kg，I/R組給予等容量生理鹽水。

1.2 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備

參照Longa線栓法[5]改良后建立大腦中動脈栓塞腦缺血再灌注損傷模型，術前禁食12 h，允許進水，麻醉后取仰臥位，結扎頸總動脈近端、頸外動脈，經頸內動脈至大腦中動脈起始部置入線栓，阻斷大腦中動脈血流，固定線栓，2 h后拔出再灌注24 h，假手術組不插入線栓只行血管分離術。

1.3 神經功能缺損評分(NDS)

再灌注24 h后，隨機取6只老鼠，參照Bederson[6]的方法進行NDS，0分：無任何神經損傷癥狀；1分：提尾時不能完全伸展；2分：爬行時向一側旋轉；3分：自發運動時向對側轉圈或傾倒；4分：無自發活動或意識完全喪失。

1.4 腦組織神經細胞凋亡的檢測

再灌注24 h后，隨機取6只大鼠，經心臟灌注4%多聚甲醛固定，取腦脫水、透明、浸蠟包埋后，于視交叉后行冠狀切片。采用TUNEL法檢測細胞凋亡，具體操作按說明書進行。皮質區隨機選取不重疊的5個視野進行陽性細胞計數，計算細胞凋亡指數(AI)：AI=凋亡細胞數÷細胞總數×100%。

1.5 腦組織MDA含量及SOD活性的檢測

再灌注24 h后，隨機取6只大鼠斷頭處死，取適量腦缺血半暗帶區組織，配制勻漿液，4 ℃下4 000 r/min，離心半徑為7.5 cm，離心20 min，取上清。按照試劑盒說明書測定MDA含量及SOD活性。

1.6 腦組織Drp 1及Cyt C 蛋白表達的檢測

再灌注24 h后，隨機取6只大鼠斷頭處死，取各組大鼠腦梗死灶組織100 mg，加入裂解液勻漿,冰上靜置2 h后，12 000 r/min，4 ℃離心10 min,取上清液,BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜，將分離的蛋白電泳至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經Drp 1、Cyt C 及GAPDH 抗體(1∶600)4℃孵育過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，PBST清洗后采用增強型化學發光試劑(ECL)顯色，圖像采用Image J軟件進行免疫印跡灰度值檢測及定量分析。

1.7 腦組織Drp 1及Cyt C mRNA表達的檢測

再灌注24 h后，隨機取6只大鼠斷頭處死，取各組大鼠腦梗死灶組織100 mg，提取總RNA，檢測RNA濃度。采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定腦組織Drp 1及Cyt C mRNA表達水平。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環35次后，72℃再延伸10 min。PCR產物在含溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外透射儀觀察照相。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法分析Drp 1及Cyt C mRNA相對表達水平。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠NDS、AI、MDA的含量及SOD活性的比較

與S組比較，I/R組與E組NDS、AI、MDA的含量明顯增加，而SOD活性顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05)。與I/R組比較，E組NDS、AI、MDA的含量明顯下降，而SOD活性顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 三組大鼠NDS、AI、MDA含量及SOD活性的比較

圖1 各組大鼠神經細胞凋亡情況

2.2 各組大鼠Drp 1和Cyt C 蛋白及mRNA的表達的比較

與S組比較，I/R組與E組Drp 1和Cyt C 蛋白及mRNA的表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與I/R組比較，E組Drp 1和Cyt C 蛋白及mRNA的表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2，圖2、3。

表2 各組大鼠腦組織Drp 1和Cyt C蛋白及mRNA表達的比較

圖2 各組大鼠大鼠腦組織Drp 1和Cyt C蛋白的表達

圖3 各組大鼠腦組織Drp 1和Cyt C mRNA的表達

3 討論

腦缺血再灌注損傷發病機制復雜，目前認為可能與大量氧自由基的產生、能量代謝障礙、細胞凋亡等因素相關[7-8]。腦損傷后，由于腦組織含有豐富易被氧化的不飽和脂肪酸，且其抗氧化及清除自由基的能力低于其他組織，極易發生氧化和抗氧化作用失衡，氧自由基產生增多，造成組織細胞嚴重氧化損傷[9-10]。依達拉奉是一種具有抗氧化應激、減輕鈣超載、抑制細胞凋亡的自由基清除劑,其脂溶性高,可透過血腦屏障，在清除自由基的同時，抑制腦細胞膜的氧化，修復受損神經細胞，改善神經功能[11]。MDA的含量間接反映組織細胞氧化應激損傷的嚴重程度；SOD的活性間接反映機體對氧自由基的清除能力[12-13],本研究結果顯示依達拉奉預處理可以顯著減少MDA含量，提高SOD活性，減輕氧化應激損傷，改善大鼠神經功能評分，具有神經保護作用。

在細胞生命活動過程中線粒體具有極其重要的作用，在生理情況下，線粒體是細胞呼吸和產生三磷酸腺苷(ATP)的場所，生成能量維持細胞的正常活性[14-15]。在氧化磷酸化的過程中，線粒體也是氧化損傷的主要靶細胞器，其損傷能夠影響線粒體功能，產生能量障礙從而加速細胞凋亡[16]。

線粒體是一個能夠進行結構和功能重組的動態細胞器，線粒體的功能受其結構的影響，其分裂融合的動態平衡是維持線粒體結構功能正常的重要機制[17]，Drp 1蛋白是一種保守的GTP酶，是線粒體分裂的主要控制蛋白[18]，腦缺血再灌注誘發氧自由基大量產生，其通過調控Drp 1相關蛋白激酶促進Drp 1的表達，Drp 1過表達能夠加速線粒體的分裂,產生大量片斷化的線粒體，誘發細胞色素C活化、釋放，介導神經細胞凋亡，造成神經細胞的缺血性損傷[19-20]。本研究結果顯示依達拉奉預處理后能夠減輕氧化應激損傷，下調Drp 1的表達，抑制Cyt C的活化、釋放，阻斷線粒體/Cyt C細胞凋亡途徑，神經細胞凋亡明顯減少。

綜上所述，依達拉奉通過減輕氧化應激，抑制線粒體分裂，減少細胞凋亡和壞死，改善大鼠腦缺血再灌注損傷，發揮腦保護作用，其具體機制還有待于深入研究。