清肺通絡合劑對氣陰兩虛兼痰熱型社區獲得性肺炎患者腸道菌群多樣性的影響

翁衛東 饒先林 陸峰彬 金 燕 柴可群

中藥清肺通絡合劑（Qingfeitongluo Mixture，QFTLM）是浙江省立同德醫院內制劑，適用于熱病后期氣陰兩虛兼余毒未清型患者，具有益氣養陰、清肺化痰的功效。以往在治療社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）恢復期氣陰兩虛兼痰熱型患者中發現，該方能顯著降低臨床證候積分[1]。為明確其療效作用機制，本研究從腸道菌群進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020 年6 月至2021 年6 月浙江省立同德醫院感染科氣陰兩虛兼痰熱型CAP 住院患者23 例，其中男11 例，女12 例；年齡23～60（38.26±9.65）歲；病程1～5（3.10±1.29）d。本研究經患者知情同意并通過醫院倫理委員會審核批準（KTSC2021226）。

1.2 納入標準 （1）CAP 西醫診斷標準符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》[2]；（2）CAP 中醫辨證分型標準參考《社區獲得性肺炎中醫診療指南（2018 修訂版）》[3]，氣陰兩虛兼痰熱型主癥：發熱、咳嗽，無痰或少痰，口干，氣短，乏力，舌紅，苔少或薄，脈細數；次癥：咳痰不爽，納差，自汗，盜汗，手足心熱，大便干、尿短赤。具備發熱、咳嗽及其他主癥或次癥2 項即可診斷；（3）年齡18～60 周歲；（4）體質指數18～25 kg/m2；（5）3 個月內未使用抗生素、益生菌、糖皮質激素、質子泵抑制劑及中草藥等；（6）無飲酒等特殊嗜好；（7）無嚴重慢性疾病史。

1.3 排除標準 （1）新型冠狀病毒感染；（2）流行性感冒；（3）重癥肺炎；（4）使用研究以外的藥物；（5）近期有急性胃腸炎或腹瀉；（6）妊娠或哺乳的婦女；（7）臨床資料不全或自依從性差者。

1.4 分組方法 采用前瞻性臨床對照研究方法，根據患者治療方法的不同，將23 例氣陰兩虛兼痰熱型CAP 患者分為兩組：抗菌藥物治療組10 例；抗菌藥物聯合QFTLM 治療組13 例。收集患者治療前（入院0～1 d）和治療1 周后（入院7～8 d）糞便樣本46 份，其中抗菌藥物組治療前后各10 份，抗菌藥物聯合QFTLM組治療前后各13 份。

1.5 藥物選擇

1.5.1 抗菌藥物 （1）頭孢噻肟鈉注射液2.0 g 靜脈滴注，每8 h1 次（山東羅欣藥業集團股份有限公司，批號322037034）聯合左氧氟沙星片0.5 g 口服，每天1 次（第一制藥北京有限公司，批號BY075G1）；（2）派拉西林/他唑巴坦注射液4.5 g 靜脈滴注，每8 h1次（瀚暉制藥有限公司，批號22013111）聯合左氧氟沙星片0.5 g 口服每天1 次。

1.5.2 QFTLM 由醫院制劑室制備（備案號：浙藥制備字Z20200045000，批號200716、210203、210208、210427、210429、210505），每瓶500 mL（每1 mL 相當于飲片0.724 g），口服，1 天2 次，每次125 mL。組方：太子參、南沙參、茯苓各15 g，炒白術、桑白皮各12 g，蘆根20 g，桔梗6 g，廣地龍9 g，丹參15 g，薏苡仁30 g，冬瓜子12 g，姜半夏9 g，砂仁（后下）5 g，甘草6 g。

1.5.3 合并用藥 體溫≥39.0 ℃可予吲哚美辛肛栓50 mg 塞肛，24 h 不超過100 mg。

1.6 檢驗方法 收集患者新鮮糞便約1 g 置于無菌試管中，立刻予-80 ℃冰箱保存，統一冷運至北京百邁客生物科技有限公司，經DNA 提取、PCR 擴增、純化、混樣、PE 文庫制備，上機PacBio 平臺進行16S rRNA 測序（V1-V9 區），下機數據經過濾、拼接、按97%相似性劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，根據聚類結果，對每個OTU 的代表序列做物種注釋，得到對應的物種及豐度信息。通過α 多樣性分析明確樣本內物種豐富度和均勻度；通過β 多樣性分析明確組間群落結構差異；通過組間顯著性差異物種分析明確各組特異性物種。

1.7 統計學方法 應用生物信息學統計分析方法，測序結果在百邁客生物信息云平臺（https://international.biocloud.net/zh/dashboard）上完成。符合正態分布的數據用均數±標準差（）表示；α 多樣性分析采用獨立樣本t 檢驗；β 多樣性分析采用主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）；組間差異顯著性分析采用方差分析和線性判別分析[line discriminant analysis（LDA）effect size，LEfSe]。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 測序數據結果分析 46 個樣本共獲得337542條有效序列，平均讀長1438～1473 bp，共鑒定出320個OTU，在各分類學水平共鑒定出10 個門、18 個綱、40 個目、68 個科、172 個屬和266 個種。以樣本稀釋性曲線（Multy samples Rarefaction Curves）（見圖1）判斷各樣本測序量是否充分，當曲線急劇上升表明測序量不足，反之則表明樣品序列充分。

圖1 樣本稀釋性曲線

2.2 兩組CAP 患者治療前后相對豐度大于1%的菌群組成 在門水平為厚壁菌門、變形桿菌門、擬桿菌門、疣微菌門和放線菌門；在綱水平為梭菌綱、革蘭陰性菌綱、芽孢桿菌綱、丹毒絲菌綱、擬桿菌綱、γ-變形桿菌綱、疣微菌綱和放線菌綱；在目水平為擬桿菌目、梭菌目、單胞菌目、腸桿菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目和顫螺菌目；在科水平為擬桿菌科、乳球菌科、腸桿菌科、韋榮球菌科、艾克曼菌科、毛螺菌科、喜熱菌科、鏈球菌科、丹毒絲菌科和腸球菌科；在屬水平為擬桿菌屬、糞桿菌屬、埃希氏菌屬、罕見小球菌屬、巨單胞菌屬、艾克曼菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬。

2.3 腸道菌群多樣性分析

2.3.1 α 多樣性分析 α 多樣性指數差異柱狀圖（見圖2），抗菌藥物組治療前后Ace 指數分別為（96.40±9.56）比（63.33±7.56）（P<0.05）（見圖2a），PD_whole_tree 指數分別為（6.43±0.56）比（4.63±0.55）（P<0.05）（見圖2b）；抗菌藥物聯合QFTLM 組治療前后Shannon 指數分別為（3.82±0.27）比（2.79±0.40）（P<0.05）（見圖2c）。提示兩組治療后α 多樣性較治療前明顯減少。

圖2 α 多樣性指數差異柱狀圖

2.3.2 β 多樣性分析 PCoA 分析圖（見圖3）中未見樣本顯著分離，采用Weight UniFrac 計算法第一主成分（The first principal component，PC1）貢獻率為30.74%。提示組間β 多樣性差異不顯著。

圖3 PCoA 分析圖

2.4 腸道菌群差異顯著性分析

2.4.1 兩組治療前后腸道菌群相對豐度的方差分析

組間方差分析柱狀圖（見圖4），其中梭菌綱的相對豐度抗菌藥物組治療前后分別為（0.48±0.24）比（0.17±0.14）（P<0.01）；抗菌藥物聯合QFTLM 組治療前后分別為（0.42±0.20）比（0.17±0.15）（P<0.05）。提示兩組治療后梭菌綱的相對豐度較治療前顯著減少。

圖4 組間方差分析柱狀圖

2.4.2 兩組治療前后顯著性差異物種分析 LDA 值分布柱狀圖（見圖5），抗菌藥物組治療前顯著性差異物種為厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目和瘤胃球菌屬，治療后為鏈球菌科、鏈球菌屬和唾液鏈球菌種（見圖5a）；抗菌藥物聯合QFTLM 組治療前顯著性差異物種為梭菌綱、梭菌目、瘤胃球菌科和毛螺菌科，治療后為腸球菌科、腸球菌屬、鳥腸球菌種和多形擬桿菌種（見圖5b）。提示兩組治療前顯著性差異物種均為梭菌而治療后出現不同變化。

圖5 LDA 值分布柱狀圖

3 討論

CAP 是常見病、多發病，是患者死亡的常見病因[4]。“腸-肺軸”概念的提出[5-6]，為研究CAP 提供了新的思路。“腸-肺軸”是指肺與腸共用一個黏膜免疫系統，通過其間的微生物對機體免疫產生相互作用和影響。腸道菌群作為其間雙向交流的重要物質，影響著呼吸系統的免疫功能和疾病的預后[7-8]。CAP 相關研究發現，致病微生物通過與呼吸道靶細胞的受體結合進入人體引發肺部炎癥，也與消化道具有相同受體的靶細胞結合破壞腸道菌群，導致細菌及其代謝產物進入循環而激活全身炎癥反應[9]。抗菌藥物是治療CAP 的常用手段，但細菌耐藥和腸道菌群失調等問題，嚴重降低了其臨床療效[10-11]。中藥具有調節腸道微生態和抗感染等多種作用[12-14]，中西醫結合可以取長補短提高臨床療效[15]。

CAP 多屬中醫“風溫肺熱病”范疇，常由外邪侵襲，肺衛受邪或正氣虧虛，抗邪無力，致風熱邪毒襲肺或風寒之邪入里化熱，煉津為痰，痰熱壅肺，肺失宣降。因熱邪極易耗氣傷陰，故風溫肺熱病早期即可見氣陰兩虛兼痰熱證候。中醫認為，肺與大腸相表里、脾與肺是母子相生關系，從辨證論治的整體觀出發，中醫治療肺病不局限于肺，常從脾胃腸入手，在清肺化痰等驅邪基礎上聯合健脾益氣養陰等治療方法。針對風溫肺熱病的特點，中醫強調應盡早益氣養陰以保存陰津、顧護正氣。QFTLM 基于上述理論組方，方中太子參補肺脾之氣，南沙參補肺胃之陰，茯苓、白術、米仁健脾化濕，桑白皮、桔梗清瀉肺火、祛痰平喘，姜半夏燥濕化痰、降逆止咳，蘆根清熱生津、祛痰排膿，冬瓜子清肺化痰、利濕排膿，丹參、地龍涼血散瘀、活血通絡，砂仁化濕和胃，甘草調和諸藥。本研究選擇氣陰兩虛兼痰熱型CAP 患者為研究對象，與以往在熱病后期使用QFTLM 不同，本研究在CAP早期即與抗菌藥物聯合使用，與單用抗菌藥物治療的患者比較腸道菌群多樣性的變化，以明確QFTLM對腸道菌群的影響。研究結果顯示，氣陰兩虛兼痰熱型CAP 患者經抗菌藥物治療1 周，腸道菌群α 多樣性明顯減少，顯著性差異物種由梭菌變為鏈球菌。QFTLM 無法完全改變這種腸道菌群α 多樣性減少，但可將顯著性差物種由梭菌改變為腸球菌和多形擬桿菌。腸球菌和多形擬桿菌是腸道中重要的菌群，在正常人體腸道中對健康有益，腸球菌能產生天然的抗生素起到抑菌作用[16]，多形擬桿菌是降解碳水化合物的優秀細菌，能加快食物中多糖的消化吸收[17]。由此推測，QFTLM 可能是通過增加腸道中對人體有益的細菌和加快食物中碳水化合物的消化吸收來促進患者臨床證候積分的改善。