肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 聯(lián)合血清TSPOT-TB在病原學(xué)陰性肺結(jié)核的診斷價(jià)值

李成行 李月翠 張莉莉 邱 帥 倪曉莉

肺結(jié)核是由結(jié)核桿菌引起的呼吸道傳染疾病，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳血、午后低燒、夜間可有盜汗、乏力、食欲減退、消瘦等[1]。肺泡灌洗液利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（XpertMTB/RIF）是基于核酸擴(kuò)增的一種半巢式熒光定量PCR 體外分子診斷技術(shù)，該技術(shù)可操作性、敏感性均較高，但操作中常因人為操作失誤或樣本質(zhì)量等問題導(dǎo)致誤診[2]；血清結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（TSPOT-TB）通過檢測(cè)結(jié)核感染后T 淋巴細(xì)胞分泌的特異性細(xì)胞因子干擾素-γ（IFN-γ）來(lái)診斷是否存在結(jié)核感染，出結(jié)果迅速，特異性好，不受卡介苗接種和環(huán)境分支桿菌影響，有檢出率快、靈敏度高等特點(diǎn)，在鑒別活動(dòng)性與潛伏性結(jié)核感染和預(yù)測(cè)結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)等方面具有重要意義[3]。對(duì)于疑似菌陰肺結(jié)核患者可考慮聯(lián)合使用這兩種方法，以提高結(jié)核病診斷的準(zhǔn)確率。本研究通過分析肺泡灌洗液XpertMTB/RIF 聯(lián)合血清TSPOT-TB 診斷對(duì)病原學(xué)陰性肺結(jié)核患者的應(yīng)用價(jià)值，探討診斷病原學(xué)陰性肺結(jié)核患者的可靠方法，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021 年2 月至2022 年2 月在浙江省永康市第一人民醫(yī)院感染科收治的120 例可疑痰病原學(xué)陰性的肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，所有患者的3 次痰抗酸桿菌涂片檢測(cè)均為陰性，且同時(shí)進(jìn)行肺部CT、支氣管鏡檢查等臨床診斷，最終將120例肺結(jié)核患者分為肺結(jié)核組和非結(jié)核組，本研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過（倫理號(hào)：ykyy2020-05），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) （1）參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2017）》[4]中有關(guān)痰病原學(xué)陰性肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）意識(shí)清醒者；（3）肝腎功能無(wú)明顯異常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重并發(fā)癥者；（2）精神障礙者；（3）伴有惡性腫瘤者；（4）肺外結(jié)核患者。

1.3 檢測(cè)方法 （1）血清TSPOT-TB 檢測(cè)：采集患者靜脈血5～8 mL，置于采血管，搖晃采血管，常溫保存，于2 h 內(nèi)分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用TSPOT-TB 試劑盒（上海復(fù)興醫(yī)藥公司）。陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5 個(gè)且抗原A 或抗原B 斑點(diǎn)數(shù)-空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6；空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)6～10 個(gè)且抗原A 或抗原B 斑點(diǎn)數(shù)≥2 倍空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。

（2）Xpert MTB/RIF 檢測(cè)：采用Olympus BFP260F 型纖維支氣管鏡進(jìn)行檢查。檢查前，使用利多卡因氣管內(nèi)黏膜表面麻醉。協(xié)助患者取仰臥位，支氣管鏡由鼻腔入，對(duì)病變情況進(jìn)行仔細(xì)檢查后，采取導(dǎo)管由病灶部位注入一定量0.9%NaCl 溶液，留取肺泡灌洗液，向所采集的肺泡灌洗液中加入等體積消化液，將其放置渦旋振蕩器震蕩20 s 左右，搖晃至沒有可見塊狀的痰標(biāo)本為止。打開Cartridge 反應(yīng)盒，用無(wú)菌吸管取出2 mL 處理后的痰樣本經(jīng)過加樣孔慢慢加入Cartridge 反應(yīng)盒里，并將Cartridge 反應(yīng)盒放置GeneXpert 系統(tǒng)（美國(guó)Cepheid 公司），約2 h 后儀器將自動(dòng)產(chǎn)生結(jié)果。

（3）MGIT960 藥敏試驗(yàn)：將2 mL 痰標(biāo)本轉(zhuǎn)移至離心管中，加入等體積4%NaCl 溶液消化15 min；取消化液離心10 min，加入pH 值為6.8 的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）5 mL，4 ℃，離心15 min，去除上清液，加入1 mL PBS 充分混勻；在MGIT 管標(biāo)簽上做好標(biāo)記，加入0.6 mL 的（油酸、白蛋白、右旋糖和過氧化氫酶）OADC 和PANTA 抗菌素混合試劑，再加入事先處理好的標(biāo)本0.5 mL，適當(dāng)混勻。將MGIT 管于BACTEC MGIT 960 全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀上培養(yǎng)，BACTEC MGIT960 熒光強(qiáng)度記憶探測(cè)器每隔60 min連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度，從而判斷管內(nèi)分支桿菌生長(zhǎng)情況。

1.4 觀察指標(biāo) 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF、血清TSPOT-TB 單一檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)涂陰肺結(jié)核的結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）評(píng)估血清TSPOT-TB、Xpert MTB/RIF 及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)菌陰肺結(jié)核診斷的特異度和敏感度，以P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組病原學(xué)陰性肺結(jié)核患者一般資料比較 兩組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組病原學(xué)陰性肺結(jié)核患者一般資料比較（例，）

表1 兩組病原學(xué)陰性肺結(jié)核患者一般資料比較（例，）

注：肺結(jié)核組為經(jīng)過肺部CT、支氣管鏡檢查等臨床診斷確診的肺結(jié)核患者；非結(jié)核組為經(jīng)過肺部CT、支氣管鏡檢查等臨床診斷的非結(jié)核患者

2.2 血清TSPOT-TB 診斷肺結(jié)核的結(jié)果分析 經(jīng)血清TSPOT-TB 檢測(cè)涂陰肺結(jié)核陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.00%（48/64），陰性預(yù)測(cè)值為73.21%（41/56）。經(jīng)肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測(cè)涂陰肺結(jié)核陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.34%（55/73），陰性預(yù)測(cè)值為82.97%（39/47）。見表2。

表2 血清TSPOT-TB 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 診斷肺結(jié)核的結(jié)果分析（例）

2.3 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 聯(lián)合血清TSPOTTB 在菌陰肺結(jié)核中的ROC 曲線分析 血清TSPOT-TB、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 及二者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的AUC 值分別為0.741、0.779、0.865，見表3。

表3 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 聯(lián)合血清TSPOT-TB在菌陰肺結(jié)核的ROC 曲線分析

圖1 肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 聯(lián)合血清TSPOT-TB 在菌陰肺結(jié)核中的ROC 曲線

2.4 Xpert MTB/RIF 診斷利福平耐藥的結(jié)果分析以MGIT 960 藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF診斷利福平耐藥性的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為88.89%（8/9）和96.86%（62/64），見表4。

表4 Xpert MTB/RIF 診斷利福平耐藥的結(jié)果分析（例）

3 討論

肺結(jié)核是一種常見的呼吸道傳染疾病，發(fā)病原因主要與環(huán)境因素、機(jī)體自身免疫力、遺傳因素等有關(guān)，容易復(fù)發(fā)，發(fā)病率逐年上升，其致死率在全國(guó)所有傳染性疾病中處于第一位。目前，我國(guó)結(jié)核病現(xiàn)狀主要為肺結(jié)核患病人數(shù)繁多、耐藥性肺結(jié)核發(fā)生的概率增多、肺結(jié)核病發(fā)現(xiàn)率低、誤診率高等[5]。為有效治愈患者和控制肺結(jié)核傳播，需提高肺結(jié)核發(fā)現(xiàn)率，減少誤診率。

本研究顯示，經(jīng)血清TSPOT-TB 檢測(cè)涂陰肺結(jié)核陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.00%（48/64）和陰性預(yù)測(cè)值為73.21%（41/56）。說(shuō)明血清TSPOT-TB 診斷涂陰肺結(jié)核患者有較高的靈敏度，這與血清TSPOT-TB 檢測(cè)能在記憶T 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子稀釋擴(kuò)散前，就迅速捕捉到細(xì)胞因子有關(guān)[6]。經(jīng)支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測(cè)涂陰肺結(jié)核陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.34%（55/73）和陰性預(yù)測(cè)值為82.97%（39/47）。說(shuō)明肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 診斷涂陰肺結(jié)核患者的靈敏性較高，這是由于肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 是自動(dòng)化操作，可以減少人工所帶來(lái)的偏差；肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 還能檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，能有效鑒定感染結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌[7]，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

利福平是利福霉素類的半合成抗菌藥，常與其他抗結(jié)核藥物共同使用，用于結(jié)核病治療，在臨床上，若患者使用利福平不當(dāng)，會(huì)出現(xiàn)耐藥情況，嚴(yán)重影響患者的臨床療效，容易出現(xiàn)“多耐藥肺結(jié)核”[8]。肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 還可根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR原理，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特有的利福平耐藥基因（rpoB 基因），分析利福平耐藥性情況。本研究顯示，以MGIT 960 藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，肺泡Xpert MTB/RIF 診斷利福平耐藥性的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為88.89%（8/9）和96.86%（62/64），說(shuō)明肺泡Xpert MTB/RIF 診斷利福平耐藥性較為可靠，為臨床治療提供了合理方案。但在細(xì)菌量級(jí)別為“極低”時(shí)，肺泡Xpert MTB/RIF 診斷無(wú)法判斷利福平耐藥情況，臨床上需要考慮其他診斷方法[9]。

本研究顯示，血清TSPOT-TB、肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 及二者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的AUC 值分別為0.741、0.779、0.865。說(shuō)明血清TSPOT-TB 和肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的準(zhǔn)確性比單獨(dú)使用血清TSPOT-TB 或支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 診斷涂陰肺結(jié)核更高。這是因?yàn)檠錞SPOT-TB 是通過測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞中能夠釋放IFN-γ 的效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)量來(lái)判斷患者是否感染結(jié)核桿菌，其陽(yáng)性結(jié)果只能說(shuō)明患者體內(nèi)存在對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T 細(xì)胞，但臨床上，堪薩斯、蘇氏、海分枝桿菌等少數(shù)非結(jié)核桿菌也能引發(fā)肺結(jié)核，因此會(huì)遺漏非結(jié)核桿菌引起感染的結(jié)核病診斷，影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性；臨床上，肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 可檢測(cè)的標(biāo)本類型多樣，最常見為痰標(biāo)本，患者往往會(huì)由于標(biāo)本留取不規(guī)范而導(dǎo)致假陰性；所以，臨床上最好將血清TSPOT-TB 和肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 二者聯(lián)合診斷病原學(xué)陰性肺結(jié)核，使得兩種檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高涂陰肺結(jié)核檢測(cè)準(zhǔn)確率。

綜上所述，泡灌洗液Xpert MTB/RIF 聯(lián)合血清TSPOT-TB 在病原學(xué)陰性肺結(jié)核診斷方面有較好的應(yīng)用價(jià)值，且肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測(cè)利福平耐藥性較可靠，值得臨床推廣。