基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接探究紅景天苷治療勃起功能障礙的作用機制

陳宣諭 張存明 馬健雄 吳忠標 葉妙勇

紅景天是景天屬多年生草本植物的根莖，《晶珠本草》記載紅景天根莖入藥有清熱解毒、扶正固本之功效，而紅景天苷則是紅景天中的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學研究表明其具有多種藥理學活性，包括心血管系統(tǒng)及神經(jīng)保護、抗炎、抗氧化、抗癌、抗代謝失調等[1-2]。勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）指男性持續(xù)性或反復發(fā)作3 個月以上不能獲得和/或維持必要的陰莖勃起完成性交，是最為常見的男性性功能障礙，約半數(shù)男性在40～70 歲之間均會呈現(xiàn)不同程度的ED[3-4]。中藥治療ED 有著數(shù)千年的歷史，現(xiàn)代藥理學研究表明，以紅景天為君藥的益氣活血方可顯著改善神經(jīng)損傷大鼠ED，并且紅景天苷能夠調控自噬改善大鼠ED[5-6]，而其作用靶點與機制尚未明確。因此，本研究通過系統(tǒng)生物學為基礎的網(wǎng)絡藥理學方法聯(lián)合基于理論模擬評估的分子對接方法，對紅景天苷治療ED 的可能靶點與機制進行探索，為紅景天苷的基礎研究與藥物研發(fā)提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）、pharmMapper（http://lilabecust.cn/pharmmapper/）、STRING 蛋白互作信息網(wǎng)站（http://string-db.org/）、SEA（Similarity ensemble approach）預測網(wǎng)站（http://sea.bkslab.org/）、Draw Venn Diagram 網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、CTD 疾病基因數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（https://omim.org/）、DisGeNet 疾病基因相關網(wǎng)站、比較毒理學數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https://ctdbase.org）、AutoDock vina 軟件、R 語言4.1.0、Cytoscape 3.8.0 軟件（http://cytoscape.org/）。

1.2 紅景天苷作用靶點 從PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得紅景天苷的SDF 文件后導入至SwissTargetPrediction 及pharmMapper 網(wǎng)站進行預測分析，設置種屬為“Homo sapiens”進行靶點預測。此外將SDF 獲得的SMILES 分子表達式導入到Similarity ensemble approach 預測網(wǎng)站篩選出藥物相關人類相關的靶點基因[7]。

1.3 ED 相關靶點收集 GeneCards 數(shù)據(jù)庫、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM、DisGeNet 疾病基因相關網(wǎng)站、CTD 疾病基因數(shù)據(jù)庫設置推理分值最低為30，將上述數(shù)據(jù)庫獲得的ED 相關靶點基因合并后刪除重復值共獲得疾病相關靶點。

1.4 紅景天苷與ED 交集靶點篩選及蛋白互作（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡構建 將紅景天苷的相關靶點與ED 相關靶點上傳至Draw Venn Diagram 網(wǎng)站進行韋恩圖繪制，并獲得交集基因。交集基因上傳至STRING 網(wǎng)站，設置medium confidence=0.4，獲得PPI 網(wǎng)絡并傳輸至Cytoscape 3.8.0 軟件后根據(jù)蛋白degree 值進行可視化作圖，由內向外degree 值由高至低。此外紅景天苷-京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路-作用靶點相互關系使用Cytoscape 進行可視化。

1.5 交集靶點功能富集分析 使用R 語言中clusterprofiler 包對紅景天苷-ED 共同靶點基因進行基因本體（gene ontology，GO）注釋及KEGG分析，結果以氣泡圖及柱狀圖呈現(xiàn)。GO 功能注釋包括生物途徑（biological process，BP），分子功能（molecular function，MF）以及細胞定位（celluar component，CC）。

1.6 核心靶基因挖掘 Cytoscape 3.8.0 軟件中使用Molecular Complex Detection（MCODE）與Cytohubba插件挖掘紅景天苷作用于ED PPI 網(wǎng)絡的核心模塊與基因[8]，插件參數(shù)設定均默認。MCODE 根據(jù)邊與節(jié)點關系，從而尋找出能夠挖掘PPI 中的核心模塊。Cytohubba 插件使用最大臨近成分（maximum neighborhood component，MNC）、最大團塊中心（maximal clique centrality，MCC）、以及相互程度拓撲算法對PPI 進行分析，分別獲得前十的靶點互作網(wǎng)絡進一步取交集。

1.7 紅景天苷與核心靶基因分子對接 采用Molecular Operating Environment（MOE）軟件進行分子對接，選取Cytohubba 與MCODE 分析出的核心靶點蛋白與紅景天苷進行對接，使用PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得紅景天苷化合物的二維結構式SDF 文件，紅景天苷的SDF 文件導入MOE 進行能量最小化操作。靶點蛋白結構來自蛋白數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB），將獲得的PDB 結構去水分子后進行預處理，將預處理的蛋白結構與紅景天苷的結構文件進行全原子模擬對接，獲得對接的二、三維結構示意圖以及分子結合能。

2 結果

2.1 紅景天苷作用靶點 PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得紅景天苷的SDF 文件導入至SwissTargetPrediction 及pharmMapper 網(wǎng)站進行預測分析，設置種屬為“Homo sapiens”進行靶點預測。此外將SDF 獲得的SMILES 分子表達式導入到SEA 網(wǎng)站，并篩選出藥物相關人類相關的靶點基因。將上述數(shù)據(jù)庫獲得的藥物相關靶點基因合并后刪除重復值共獲得藥物相關靶點379 個。

2.2 ED 相關靶點收集 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中獲取ED 相關靶點1700 個，人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫獲得的ED 相關靶點15 個，DisGeNet 疾病基因相關網(wǎng)站獲得ED 相關靶點256 個，CTD 疾病基因數(shù)據(jù)庫獲得ED 相關靶點1585 個，將上述數(shù)據(jù)庫獲得的ED相關靶點基因合并后刪除重復值共獲得疾病相關靶點2869 個，與紅景天苷的藥物相關靶點取交集得到142 個交集基因（見圖1）。

圖1 疾病及藥物潛在靶點

2.3 核心靶基因網(wǎng)絡圖及分析 STRING 網(wǎng)絡得到交集基因的PPI 網(wǎng)絡圖有142 個網(wǎng)絡節(jié)點，1304 條相互作用的網(wǎng)絡圖（見圖2），并對蛋白網(wǎng)絡節(jié)點相互作用大小進行排序，其中排名前十的節(jié)點為AKT1、GAPDH、VEGFA、IL6、EGFR、SRC、CASP3、HSP90A -A1、HRAS、ESR1。

圖2 紅景天苷作用靶點蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖

Cytohubba 的拓撲分析算法共獲得VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1、AKT1、IGF1R、MMP9、EGFR 核心靶基因共12 個（見圖3A），MNC、MCC、Degree 的交集靶點8 個，包括VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1。MCODE 分析得分最高的兩個模塊，分數(shù)分別是22.6 與6.296。兩個模塊均包含了使用Cytohubba中分析得到的8 個核心靶基因，表明VEGFA、CASP3、HSP90AA1、SRC、IL6、GAPDH、HRAS、ESR1的重要功能（見圖3B、3C）。

圖3 Cytohubba 與MCODE 分析核心靶點

2.4 交集靶點功能富集分析 GO 富集分析上述142 個交集基因，獲得GO 富集的結果以調整后的P值進行排序，并使用R 語言繪制柱狀圖（見圖4），其中GO 富集的生物過程（biological process，BP）主要涉及肌細胞增殖、細胞氧化應激反應、氧化應激反應、類固醇激素的反應、活性氧反應等；GO 富集的分子功能（molecular function，MF）主要涉及囊腔、胞質囊腔、膜筏、膜微結構域等；GO 富集的細胞組分（cellular component，CC）主要涉及核受體激活、轉錄因子激活-直接配體調控序列特異性DNA 活性、蛋白酪氨酸激酶活性、肽活性等。交集基因的KEGG 富集分析結果根據(jù)調整后P 值進行排序后使用R 語言繪制氣泡圖（見圖5），主要包括PI3K-AKT 信號通路、癌癥蛋白聚糖通路、Rap1 信號通路、肝細胞癌通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路、前列腺癌通路、HIF-1 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抵抗通路、膀胱癌等，其中PI3K-AKT 信號通路的GeneRation 為0.213，涉及該條通路的差異基因包括AKT1、AKT2、、CDK2、CDK6、EGFR、EPHA2、ERBB4、、FGF1、FGF2、FGFR1、GSK3B、HRAS 等。

圖4 紅景天苷治療ED 靶點的GO 富集分析

圖5 紅景天苷治療ED 靶點的KEGG 富集分析

2.5 紅景天苷與ED 關鍵靶點的分子對接 紅景天苷與Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、IL6、VEGFA 的分子結合能分別為-5.8730、-6.3824、-6.7591、-5.5853、-5.9959 kcal/mol（見表1），分子結合能數(shù)值越小表明二者的結合程度緊密，能夠發(fā)揮更強的相互作用，其中結合能<-5 表示二者對接程度較好。紅景天苷與Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、IL6、VEGFA 的對接程度均較好，二、三維對接圖表明紅景天苷處于Caspase-3、ESR1、HSP90AA1、VEGFA 的活性口袋，因此對紅景天苷的包裹更佳（見圖6）。

圖6 藥物-核心靶點對接圖

表1 紅景天苷與靶基因結合能

3 討論

ED 中醫(yī)謂之“陽痿”，表現(xiàn)為陰莖無法勃起、勃而不堅、堅而不久，從而導致無法獲得滿意的性交[9]。前期研究表明紅景天為君藥的益氣活血方能夠引氣血入下焦起痿，改善海綿體神經(jīng)損傷后大鼠ED，而紅景天苷作為紅景天主要活性成分能夠調控自噬改善海綿體神經(jīng)損傷大鼠ED[5-6]，但是否有其他的作用靶點及機制仍需明確。現(xiàn)代網(wǎng)絡藥理學結合分子對接的方法能夠較為全面地挖掘中藥作用機制并初步闡明中藥藥理學作用機制[10]。

陰莖海綿體內皮細胞與平滑肌均可分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGFA 是VEGF 家族研究最為廣泛的亞型，作為一種多功能糖蛋白，可促進海綿體平滑肌與內皮細胞的增殖，促進血管生成，刺激內源性NO 的產(chǎn)生維持陰莖勃起[11]。此外，ED 男性患者與雄性大鼠分別與正常對照比較，VEGFA 的表達量減少，因此VEGFA可能是治療ED 的重要靶點[12]。本研究顯示，VEGFA靶點富集顯著，而Ariyanti 等[13]研究表明紅景天苷能夠改善糖尿病患者下肢缺血并發(fā)癥，通過促進VEGFA 分泌增強內皮細胞和平滑肌細胞的增殖和遷移潛能，誘導新生血管生成及血流灌注恢復，因此VEGFA 可能是紅景天苷治療ED 的重要治療靶點。

陰莖海綿體細胞的過度凋亡會引起ED，因此抑制凋亡達到治療ED 的目的[14]。Caspase 家族成員在細胞凋亡信號轉導中發(fā)揮主導作用，尤其是Caspase3 作為細胞凋亡執(zhí)行者，而紅景天苷與Caspase3對接活性良好。目前大量研究顯示紅景天苷能夠抑制細胞凋亡[15-16]，此外紅景天苷能夠抑制低氧誘導的Caspase3 表達進而改善大鼠海綿體平滑肌細胞凋亡[17]。

合并糖尿病、高血壓及神經(jīng)損傷的ED 患者可出現(xiàn)陰莖海綿體平滑肌細胞由“收縮型”向“合成型”的表型轉化，由于維持陰莖舒張和收縮功能的基本單位受損從而產(chǎn)生ED[18]。Okumu 等[19]對新生大鼠連續(xù)使用己烯雌酚干預6 d、21 d 后出現(xiàn)永久性陰莖畸形，陰莖實時熒光定量PCR 顯示雌激素受體1（ESR1）表達均明顯增加，肌球蛋白重鏈11（MYH11）mRNA 與蛋白表達量降低，同時α 平滑肌肌動蛋白免疫組化染色表達減少，表明大鼠海綿體平滑肌細胞分化受到阻礙，然而使用ESR 拮抗劑后上述表性改變得到逆轉，因此ESR 通路可通過調控陰莖海綿體平滑肌細胞分化維持正常陰莖形態(tài)。研究表明，紅景天苷可調控大鼠體內、外缺氧誘導的陰莖海綿體平滑肌細胞表型轉化[20]，而從雌激素及其受體通路著手研究海綿體表型轉化與ED 的研究尚未見報道。

KEGG 通路富集分析結果顯示，紅景天苷治療ED 的分子機制與PI3K/AKT 信號通路相關，并且該信號通路富集的基因最多，同時AKT1 是交集蛋白互作中最顯著的靶點，提示紅景天苷可能通過PI3K/AKT 通路治療ED。基礎研究表明，PI3K/AKT 與ED密切相關，其中代謝綜合征與糖尿病誘發(fā)ED 的大鼠可通過調控陰莖海綿體內PI3K/AKT 促進eNOS（Ser1177）磷酸化水平及內皮細胞增生，從而提高NO 與cGMP 的含量改善勃起功能[21-22]。

綜上所述，本研究表明紅景天中的主要成分紅景天苷能夠通過多成分-多靶點-多通路治療ED，為紅景天進一步實驗研究和臨床應用提供了新方向與思路。通過分子對接驗證發(fā)現(xiàn)，紅景天苷與五組靶標蛋白結合性較好，且紅景天苷處于靶標蛋白的活性口袋。基于網(wǎng)絡藥理學研究藥物分子靶點治療疾病仍存在不足，其能夠系統(tǒng)預測作用靶點及通路，但是仍需要通過開展體內與體外實驗進行驗證。