凱里酸湯對大鼠非酒精性脂肪肝病作用的分子機制*

李燚， 叢碩， 唐娟， 劉邵雯， 趙珮伶， 劉詠梅**

(1.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550025)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種肝臟異位脂質累積的慢性肝病，目前尚無被批準的標準療法[1]。飲食干預已被證明是防治NAFLD的有效方法[2]。凱里紅酸湯是一種傳統食品，主要由西紅柿和紅辣椒等發酵而成，富含礦物質、有機酸、番茄紅素及辣椒堿等成分[3-6]，具有降脂、抗氧化和抗炎作用[7-9]，對健康十分有益。本課題組前期研究發現凱里酸湯可影響NAFLD大鼠肝臟的蛋白質組學[10]，但其在NAFLD中的作用機理復雜，其作用的靶點及相關分子機制還需深入探討。因此，本研究基于網絡藥理學的方法對凱里酸湯進行生物信息學分析并進行體內驗證，探討凱里酸湯改善NAFLD的可能機制，以期為凱里酸湯對NAFLD食療作用提供進一步證據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 6周齡無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級Sprague Dawley (SD)雄性大鼠18只，體質量180～200 g，購自中國遼寧長生生物技術股份有限公司。本研究獲學校動物倫理委員會批準[1901071，動物許可證號為SCXK(遼)2015-0001]。

1.1.2主要試劑及儀器 凱里酸湯(貴州亮歡寨餐飲娛樂管理有限公司)，PrimeScript RT試劑盒與SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑(日本Takara公司)，引物(上海生工生物技術有限公司合成)，兔抗過氧化物酶激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)一抗、兔抗磺基轉移酶1 E1(sulfotransferase1 E1, SULT1E1)一抗及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG[goat anti-rabbit igg fc (HRP) conjugation, IgG-HRP]二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，兔抗雌激素受體α(estrogen receptor α, ERα/ESR1)一抗(成都正能生物技術有限公司)，蛋白提取試劑(蘇州新賽美生物科技有限公司)，Trizol試劑和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；羅氏LightCycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 儀、Roche Cobas 8 000 C702生化分析儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 研究方法

1.2.1網絡藥理學分析 Pubmed、中國知網、萬方文獻數據庫、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)，PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、相似性集成算法(Similarity ensemble approach, SEA;http://sea.bkslab.org/)、SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)、SuperPred (https://prediction.charite.de/)、Uniprot (https://www.uniprot.org/help/uniprotkb)、Genecards (https://www.genecards.org/)及DisGeNet (https://www.disgenet.org/)數據庫挖掘凱里酸湯化合物成分、疾病及成分靶點；基于STRING 11.5平臺(https://string-db.org/)、微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)、注釋、可視化和綜合發現(the database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID;https：//david.ncifcrf.gov/)數據庫及Cytoscape 3.9.0軟件進行數據分析及可視化。

1.2.2凱里酸湯化合物成分及靶點篩選 基于 Pubmed、中國知網及萬方文獻數據庫并結合TCMSP、PubChem等數據庫篩選收集凱里酸湯中所含化合物成分及其結構信息；在SEA、SwissTargetPrediction(納入P>0.1的潛在蛋白靶標)及SuperPred(納入P>0.5的潛在蛋白靶標)數據庫中輸入化合物的Canonical SMILES格式，根據分子相似性匹配工具以識別化合物成分的潛在靶蛋白，合并去重后利用Uniprot數據庫標準化以建立化合物成分靶點數據集。

1.2.3疾病靶點收集與交集靶點的獲取 以“nonalcoholic fatty liver disease”“fatty liver disease, nonalcoliholic”等為關鍵詞，通過Genecards及DisGeNet數據庫挖掘NAFLD相關調控基因，合并2個數據庫所獲靶點，刪除重復值后建立NAFLD靶點數據集；利用Venn工具將酸湯化合物靶點與疾病靶點取交集并繪制韋恩圖。

1.2.4構建網絡圖與共同靶點相互作用網絡 為明確凱里酸湯對化合物靶點及NAFLD相關靶點之間的作用，利用Cytoscape 3.9.0軟件建立“凱里酸湯-化合物-靶點-NAFLD”的網絡圖。交集靶點上傳至STRING 11.5平臺構建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction networks, PPI)網絡模型[11]，物種為“Homo Sapiens”，等值置信度0.4，其余參數為默認值。Cytoscape 3.9.0軟件對PPI進行可視化與拓撲屬性分析，采用CytoNCA插件分析網絡的度中心性(degree centrality, DC)、中介中心性(betweenness centrality, BC)及接近中心性(closeness centrality, CC)，各取3種算法中排名前15的節點，同時獲取分子復合物檢測(molecular complex detection, MCODE)插件所得分值最高的子網絡節點，4者取交集以篩選關鍵靶點并繪制網絡。

1.2.5基因本體(gene ontology, GO)與京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genome, KEGG)通路富集分析 將關鍵靶點基因輸入DAVID數據庫進行GO注釋分析，包括分子功能(molecular functions, MF)、生物過程(biological processes, BP)、細胞成分(cellular components, CC)及KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，對排名靠前的生物過程和通路進行可視化。

1.2.6動物造模及分組 18只大鼠隨機均分為對照(normal diet, ND)組、模型(high-fat diet model, HF)組及凱里酸湯干預(Kaili sour soup intervention in high-fat model, HS)組。ND組大鼠給予正常飼料，HF組和HS組大鼠給予高脂飼料以構建NAFLD模型；HS組在建模的同時予1 mL/100 g酸湯灌胃(造模過程參考本課題組前期實驗方法[10])，1 次/d，連續12周。第12周末水合氯醛麻醉各組大鼠，心臟穿刺取血后摘取肝臟，肝左葉浸泡于10%多聚甲醛，剩余肝組織于-80 ℃保存。

1.2.7血清生化指標檢測 取“1.2.6”項下各組大鼠血液靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，羅氏Cobas 8000 C702生化分析儀的連續檢測法檢測各組大鼠血清天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、甘油三脂(triglycerides, TC)及總膽固醇(total cholesterol, TG)含量。

1.2.8肝組織的形態學特征 取“1.2.6”項下各組大鼠肝左葉于10%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，切為3 μm厚的石蠟切片，進行蘇木素-伊紅(haematoxylin-eosin, HE)染色和油紅O染色后于光學顯微鏡鏡下觀察肝組織結構和脂滴形成情況。

1.2.9RT-qPCR法檢測目的分子基因水平 用Trizol提取“1.2.6”項下各組大鼠肝組織總RNA，PrimeScript RT試劑盒反轉錄RNA為互補DNA(complementary DNA, cDNA)后，按SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑說明在羅氏LightCycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR儀進行擴增檢測，β肌動蛋白(beta-actin, Actb)為標準內參照，2-ΔΔCt法計算基因相對表達。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.10Western blot 蛋白裂解液提取“1.2.6”項下各組大鼠肝組織總蛋白，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清以BCA法定量肝組織總蛋白；蛋白通過電泳分離、轉膜、5%脫脂牛奶搖動封閉，SULT1E1、PPARα及ERα一抗4 ℃孵育過夜、羊抗兔二抗室溫孵育1 h，利用伯樂凝膠成像系統拍攝蛋白條帶，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.11免疫組織化學(immunocytochemistry, IHC)染色 取“1.2.6”項下各組大鼠肝組織切片，脫蠟水化，抗原修復，封閉，以PPARα、SULT1E1及ERα一抗于4 ℃孵育過夜，二抗于37 ℃ 孵育30 min，鏡下觀察二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)顯色情況，復染細胞核，切片封片后于光學顯微鏡下觀察、拍照，利用ImageJ軟件計算圖片累積光密度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 凱里酸湯化合物靶點及NAFLD靶點的篩選

通過文獻數據庫并結合TCMSP、PubChem數據庫，凱里酸湯中篩選出辣椒素、二氫辣椒素、番茄紅素、13Z番茄紅素、黃酮、維生素E、維生素C、乳酸、乙酸、檸檬酸及酒石酸11個主要化合物成分，得到凱里酸湯化合物對應靶點584個、NAFLD相關靶點1 867個，并通過Venn圖制作工具得到共同靶點190個。見表2和圖1。

表2 凱里酸湯所含化合物成分信息Tab.2 Compound information in Kaili Sour Soup

注：粉色為凱里酸湯化合物對應靶點，綠色為NAFLD相關調控靶點，交集為共同靶點。圖1 酸湯化合物成分-NAFLD靶點的篩選Fig.1 Venn diagram showing shared targets between Kaili sour soup compound targets-NAFLD targets

2.2 “凱里酸湯-化合物-靶點-NAFLD”網絡

通過Cytoscape 3.9.0軟件構建“凱里酸湯-化合物-靶點-NAFLD”網絡，以不同的顏色和形狀標注化合物成分及疾病靶點之間的關系，結果顯示，凱里酸湯中的化合物成分有其特定的靶點，同時與NAFLD之間存在共同靶點，從而構成復雜網絡。見圖2。

注：C1～C11分別表示辣椒素、二氫辣椒素、番茄紅素、13Z番茄紅素、黃酮、維生素E、維生素C、乳酸、乙酸、檸檬酸及酒石酸；綠色三角形為化合物成分對應靶點，最外層淺紫色為化合物與疾病共同作用靶點。圖2 “凱里酸湯-化合物-靶點-NAFLD”的網絡關系Fig.2 Network of the shared targets between Kaili sour soup-compound targets and NAFLD targets

2.3 關鍵靶點獲取及生物信息學分析

利用Cytoscape 3.9.0軟件分析獲得關鍵靶點12個(表3和圖3A)；通過STRING平臺構建PPI網絡，其中每個節點為蛋白靶點，連線為蛋白之間的相互作用(圖3B)；使用DAVID數據庫對關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析，GO結果顯示關鍵靶點與細胞對有機物的反應、調節活性氧的代謝過程、RNA聚合酶轉錄調控及蛋白復合物的形成等生物過程調控相關(圖3C)，KEGG通路富集分析結果顯示關鍵靶點主要參與雌激素信號通路、癌癥相關通路及乙型肝炎相關通路等(圖3D)。

表3 12個關鍵靶點Tab.3 Twelve hub targets

注：A為MCODE插件及CytoNCA插件3種算法(BC、CC、DC)以獲取的關鍵靶點(四者交集)；B為12個關鍵候補蛋白的PPI網絡(不同顏色連線為蛋白之間的不同作用)；C為12個關鍵靶點的GO富集分析(包括BP、CC、MF，條圖藍色至紅色變化表示調整P值)；D為12個關鍵靶點的KEGG富集分析的桑葚氣泡圖(氣泡顏色表示調整P值)。圖3 關鍵候補靶點的相關分析Fig.3 Analysis of hub candidate targets

2.4 血清AST、ALT、TG及TC水平

與ND組比較，HF組大鼠血清AST、ALT、TG及TC水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與HF組相比，HS組大鼠血清AST、ALT、TG及TC水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清AST、ALT、TC及TG水平Tab.4 Levels of rat serum AST, ALT, TC, and TG in each group

2.5 肝組織的形態學特征

HE染色結果顯示，ND組大鼠肝組織結構正常，肝細胞索呈放射狀排列，間界線清晰，油紅O染色顯示無脂滴形成；與ND組比較，HF組大鼠肝細胞腫脹，多數細胞的胞漿內有小脂肪空泡形成，胞漿界限不清，脂滴大量形成；與HF組相比，HS組大鼠肝組織病理學形態變化得以改善，脂滴減少。見圖4。

圖4 各組大鼠肝組織的形態學特征(200×)Fig.4 Morphological characteristics of rat liver tissues in each group(200×)

2.6 肝組織中PPARα、SULT1E1及ERα表達

結果顯示，與ND組比較，HF組大鼠肝組織中SULT1E1蛋白和mRNA的水平升高，PPARα、ERα 蛋白和mRNA的水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HF組比較，HS組大鼠肝組織中SULT1E1蛋白和mRNA的水平降低，PPARα、ERα 蛋白及mRNA的水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5和圖5。

表5 各組大鼠肝組織PPARα、SULT1E1及ERα蛋白與mRNA的水平Tab.5 The relative mRNA and protein expression levels of PPARα, SULT1E1 and ERα in each

圖5 各組大鼠肝組織PPARα、SULT1E1及ERα蛋白的電泳結果Fig.5 Electrophoresis results showing rat liver PPARα, SULT1E1 and ERα proteins in each group

2.7 免疫組織學染色

IHC結果顯示，PPARα及ERα在ND組及HS組大鼠肝臟組織中呈棕色分布在肝細胞核內或核周；與ND組比較，HF組大鼠肝臟組織中PPARα表達減少(P<0.05)、ERα表達無差異(P=0.18)，而HS組中PPARα和ERα較HF組增加(P<0.05)；SULT1E1在HF組表達增加，主要分布于胞漿內；與HF組相比，ND組及HS組大鼠肝組織中SULT1E1表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6和圖7。

注：黑色方框表示同組同蛋白200倍放大的位置。圖6 各組大鼠肝組織PPARα、SULT1E1及ERα的IHC染色結果Fig.6 Immunohistochemical staining of rat liver PPARα, SULT1E1, and ERα in each group

注：(1)與ND組比較，P<0.05；(2)與HF組比較，P<0.05。圖7 各組大鼠肝組織PPARα、SULT1E1及ERα的表達Fig.7 Expression levels of rat liver PPARα, SULT1E1, and ERα in each group

3 討論

NAFLD的患病率呈逐年上升趨勢，已成為一個亟需解決的公共健康問題[1]，網絡藥理學整體性、系統性的分析方法能夠為揭示疾病的防治策略提供新思路[12]。本研究基于文獻報道及網絡藥理學的方法，篩選得到凱里酸湯的主要成分，并分析得到調控NAFLD的關鍵靶點，結果顯示這些基因靶點直接或間接的參與多個生物學過程，并通過雌激素信號等通路可能在NAFLD的防治中起作用。

NAFLD發病與脂肪酸代謝紊亂、胰島素抵抗等相關[13]。PPI網絡分析結果顯示，PPARα和ERα是凱里酸湯改善NAFLD的關鍵靶點，提示PPARα和ERα與NAFLD之間存在緊密聯系。肝臟PPARα可調節肝臟中游離脂肪酸的攝取、氧化及甘油三酯水解所需的基因的表達，作為脂質傳感器調節脂肪酸代謝[14]，同時PPARα在葡萄糖穩態和胰島素抵抗中發揮重要作用[15]，其表達的降低有利于抑制NAFLD發展[16]。ERα是循環雌激素在肝臟中發揮作用的關鍵分子之一，肝臟ERα的缺失會導致雌激素減輕肝臟脂肪變性能力的喪失[17-18]；缺乏雌激素信號可能導致胰島素抵抗，進而增加NAFLD的患病風險，已有研究表明由于雌激素水平的下降導致絕經后女性NAFLD的發生率較男性更高[19-20]。本研究中KEGG富集分析顯示凱里酸湯改善NAFLD的途徑主要為雌激素信號通路、癌癥相關通路等，表明雌激素信號的正常傳遞在NAFLD的發展中起重要作用。

為進一步探究凱里酸湯改善NAFLD可能的分子機制，本研究利用高脂飲食構建NAFLD大鼠模型進行實驗驗證。長期高熱量飲食可導致體內能量代謝失衡，過剩的能量經轉化為脂質后在脂肪組織和肝臟中累積，導致肝臟發生脂肪變性[21]。肝細胞受損可導致血清中AST、ALT水平升高[8]，此外血清TG、TC是反映脂質代謝的重要生化指標[22]。本研究中，HF組大鼠血脂水平及肝組織脂滴均明顯上調，與此前研究一致[22]；HS組大鼠血清AST、ALT、TC及TG水平均降低，且肝組織結構紊亂得以緩解，提示凱里酸湯能夠減輕肝臟脂肪沉積并降低血脂水平。

本課題組前期研究表明，SULT1E1可能是治療NAFLD的潛在靶點[10]。SULT1E1是肝臟Ⅱ相代謝(也稱結合反應)酶中細胞質磺基轉移酶1(cytosolic sulfotransferases，SULTs)亞家族的一個異構體[23]，能夠磺化雌激素，使其與雌激素受體的結合能力喪失[24]，干擾雌激素信號轉導。研究發現高表達的SULT1E1能夠增加高膽固醇和高脂飲食雄性小鼠對NAFLD/NASH的敏感性[25]，并具有促進人體脂肪生成的能力[26]。Li等[27]研究表明，使用PPARα激動劑處理人血管內皮細胞和平滑肌細胞，可降低SULT1E1的活性，可能與PPARα在轉錄水平調節SULT1E1表達有關。本研究采用RT-qPCR、Western blot及IHC檢測了PPARα、SULT1E1及ERα在肝組織中的表達，結果顯示HF組大鼠肝組織中SULT1E1表達增加、PPARα表達降低，提示高脂飲食改變了PPARα的表達，從而可能導致SULT1E1水平變化。與Gorres等[28]研究結果類似，本研究結果顯示HF組大鼠肝組織中ERα表達降低，這可能與肝臟中高表達的SULT1E1導致雌激素水平降低有關；與HF組結果相反，HS組NAFLD大鼠肝組織中SULT1E1表達降低，PPARα及ERα表達水平增加，這可能導致NAFLD大鼠肝臟中雌激素信號恢復，從而緩解肝臟脂質代謝穩態失調，進而改善NAFLD[29]。

綜上，本研究從生物信息學角度分析了凱里酸湯的化合物成分及其靶點，并構建了“凱里酸湯-化合物-靶點-NAFLD”網絡圖以顯示凱里酸湯對NAFLD的作用，通過富集分析、體內實驗并結合前期工作對所獲分子進行驗證，結果顯示凱里酸湯可能通過PPARα/ SULT1E1/ERα/雌激素信號轉導在NAFLD中發揮有益作用，但其深入調控機制還需進一步研究和證實。