miR-25調(diào)控Notch信號通路對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染小鼠記憶容量和腦損傷的影響*

李成， 黃學(xué)卿， 王黎洲， 周石， 許敏， 安天志*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 影像學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

全世界估計有5 000萬人患有癡呆或阿爾茨海默病，同時超過700萬人患有帕金森病，超過200萬人患有多發(fā)性硬化[1]，且這些神經(jīng)元退行性疾病的發(fā)病率隨著人口老齡化將持續(xù)增加[2]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的退行可能也和遺傳以外的因素相關(guān)，多年來大量研究認(rèn)為病毒、細(xì)菌及真核寄生蟲感染是神經(jīng)退行性疾病的可能觸發(fā)因素，然而并沒有任何一種感染被確定為病因[2-3]。感染導(dǎo)致的后果之一是炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的增加，這些可能會導(dǎo)致認(rèn)知功能受損[4]。雖然越來越多的研究集中在神經(jīng)炎癥以及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等大腦免疫細(xì)胞影響的細(xì)胞因子和趨化因子的表達和反應(yīng)上，但這些反應(yīng)影響腦細(xì)胞的機制仍不清楚[5]。microRNA(miRNA)是一種小的(18～22堿基對)高度保守、可以調(diào)控蛋白表達、調(diào)控大多數(shù)轉(zhuǎn)錄后生物學(xué)過程的非編碼RNA[6-7]，證據(jù)表明不同miRNA在疾病發(fā)生和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療方法中扮演重要的角色，例如miR-212/132調(diào)控癲癇的發(fā)生，而miR-124和miR-9可以促進神經(jīng)生長[8-9]。近期研究多關(guān)注于miR-25的作用，但其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用知之甚少[10]。Notch信號通路調(diào)控大多數(shù)組織的發(fā)育，也可以調(diào)控正常細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的分化、增殖及生存[11]。Notch信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果需要微調(diào)Notch目標(biāo)基因的表達以使細(xì)胞可以適應(yīng)生理環(huán)境下的變化，例如缺氧、輻射、炎癥及氧化應(yīng)激等不同條件都會影響Notch的活性，但是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控Notch目標(biāo)基因表達的機制仍不清楚[12]。有研究表明Notch可以保護CNS并改善現(xiàn)有的認(rèn)知功能受損[13]，γ-分泌酶是Notch信號通路中的關(guān)鍵酶，可以促進Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch intracellular domain,NICD)的釋放；加入γ-分泌酶的抑制劑DAPT后，γ-分泌酶的活性被有效抑制，同時可以避免γ-分泌酶Notch受體水解成NICD，由此阻止下游基因的表達[14]。通過生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，miR-25和Notch受體Notch1之間有靶向關(guān)系，因此本研究考慮miR-25可能通過下調(diào)Notch-1的表達來抑制Notch信號通路，從而促進導(dǎo)致腦組織損傷的免疫炎癥的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物和細(xì)胞來源 70只清潔級健康、雄性C57BL/6小鼠，2周齡，體質(zhì)量30～40 g，購自本院動物中心，實驗按照動物研究體內(nèi)實驗報告指南，并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(2000658)；人胚腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞由學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室贈送。

1.1.2主要試劑和儀器 脂多糖和苯甲基磺酰氟(北京索萊寶)，胰蛋白酶(武漢Servicebio Technology)，Rellina質(zhì)粒、Trizol及蛋白定量試劑盒(上海賽默飛)，雙螢光素酶報告試劑盒(北京Promega)，SYBR?PremixExTaqTMⅡ 試劑盒(廣州培育)，聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride,PVDF)膜(美國Millipore)，兔抗小鼠 Notch1、兔抗小鼠Hes5及兔抗小鼠環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2；英國Abcom)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(北京中山生物)，miR-25模擬物、miR-25抑制劑及(2S)-N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-2-苯基甘氨酸叔丁酯{N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT；上海嶸葳}，5%脫脂牛奶和胰蛋白酶(武漢Servicebio Technology)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA；南京建成生物)；Bio-Rad 圖像分析系統(tǒng)(美國 BIORAD)，增強型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)超高敏發(fā)光液(美國 Amersham)。

1.2 研究方法

1.2.1雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)分析 通過生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站(www.targetscan.org)分析 miR-25和 Notch1的結(jié)合位點，用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-25和Notch1的關(guān)聯(lián)。分別構(gòu)建PGL3-Notch1野生型(目標(biāo)基因Notch1的雙螢光素酶報告基因載體)和 PGL3-Notch1 突變型(在結(jié)合位點處突變的miR-25的雙螢光素酶報告基因載體)。將1個Rellina質(zhì)粒和2個報告質(zhì)粒分別與miR-25質(zhì)粒、空載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入 HEK293T 細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染24 h后用雙螢光素酶報告試劑盒進行雙螢光素酶實驗驗證miR-25和Notch1的關(guān)聯(lián)。

1.2.2分組及取樣 采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為正常對照組(n=10，不作處理)和實驗組(n=60)。實驗組小鼠側(cè)腦室中注入500 μg/kg 脂多糖建立小鼠CNS感染模型[15]；建模成功后，隨機均分為模型組(建模后無處理)、空載體組(建模后注射空載體)、miR-25模擬物組(注射miR-25模擬物)、miR-25抑制劑組(注射miR-25抑制劑)、DAPT組(注射γ-分泌酶抑制劑DAPT)及miR-25制劑+DAPT組(注射miR-25抑制劑和DAPT)；建模成功后第2天，2%戊巴比妥酸麻醉實驗組小鼠，用牙鉆從小鼠海馬齒狀回背側(cè)縱軸垂直注射3 mmol/L相應(yīng)試劑，1次/周，共3次。待實驗組小鼠最后1次注射1 h后，所有小鼠在莫里斯水迷宮中測學(xué)習(xí)記憶能力；脊髓離斷法處死小鼠，取腦組織做生化分析、取海馬組織液氮保存做表達分析。

1.2.3莫里斯水迷宮 處理結(jié)束時，取各組小鼠進行莫里斯水迷宮測試。莫里斯水迷宮是一個恒溫保持在20～25 ℃的環(huán)形水池(150 cm×60 cm)，被分成右下、右上、左下及左上4個象限，一個平臺安裝在右下象限；將各組小鼠從不同象限面壁放入池中，1次/d，記錄小鼠爬上平臺的時間為逃生潛伏期；第5～7天移除水下平臺，進行空間探索實驗，記錄小鼠在平臺所在的象限(目標(biāo)象限)停留的時間和經(jīng)過原平臺的次數(shù)，停留時間較長和經(jīng)過次數(shù)較多表明小鼠有較強的學(xué)習(xí)記憶能力[16]。

1.2.4實時熒光定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR) 取“1.2.2”項下各組小鼠腦組織，采用 Trizol來提取腦組織中所有的 RNA，反轉(zhuǎn)錄DNA(complementary DNA,cDNA)用含有逆轉(zhuǎn)錄引物的 TaqMan MicroRNA Assays 來合成，用SYBR?PremixExTaqTMⅡ 試劑盒進行熒光定量 PCR檢測腦組織中miR-255、Notch1及Hes家族BHLH轉(zhuǎn)錄因子5(hes family BHLH transcription factor 5，Hes5)、COX-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inductible nitric oxide synthase, iNOS)的表達水平，實驗于10 μL系統(tǒng)中完成：ddH2O 2.2 μL、PCR上下游引物0.4 μL、SYBR?PremixExTaqTM Ⅱ(2×)5 μL、ROX Reference Dye(50×)1 μL及DNA模板1 μL；熒光定量PCR在 BIORAD 系統(tǒng)中進行，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min、60 ℃延伸1 min、40 個循環(huán)；內(nèi)參引物U6作為miR-25的內(nèi)參，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為其他基因的內(nèi)參，2-ΔΔCt表達每個目標(biāo)基因的相對表達量(表1)。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.5蛋白質(zhì)印跡 取“1.2.2”項下各組小鼠腦組織，用含有苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)的放射免疫沉淀法裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA )裂解物中提取總蛋白；用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒來檢測蛋白濃度。將樣品與樣品緩沖液混合并在沸水中孵育10 min；每孔加蛋白質(zhì)樣品30 μg，80 V恒定電壓下電泳2 h；蛋白質(zhì)于110 V電壓下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上2 h；5%脫脂牛奶于4 ℃下封閉PVDF膜上的蛋白質(zhì)2 h；棄封閉緩沖液，Tris-Buffered Saline and Tween 20(TBST) 清洗膜1次；接加兔抗小鼠 Notch1、Hes5、COX-2、iNOS及GAPDH ，4 ℃孵育1夜；加辣根過氧化物酶( horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體 (1 ∶5 000)，孵育2 h；TBST 沖洗，ECL 檢測試劑盒顯影PVDF膜；使用 Bio-Rad 圖像分析系統(tǒng)采集圖像，用Image J分析數(shù)據(jù)。

1.2.6海馬組織中SOD和MDA水平的測定 用水溶性四氮唑(tetrazole,WST-1)法測定海馬組織中的SOD水平，用硫代巴比妥酸實驗測定MDA水平。取“1.2.2”項下各組小鼠腦組織，切成1 mm3小塊，胰蛋白酶于37 ℃消化30 min，PBS終止消化；300 μm尼龍篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞；SOD和MDA水平的測定嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-25 反向調(diào)控Notch1 基因

采用生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站(www.targetscan.org)預(yù)測miR-25和Notch1基因的具體結(jié)合位點(表2)，miR-25與Notch1的3′UTR結(jié)合序列為UGCAAU。與空載體組比較，miR-25模擬物組的野生型Notch1共轉(zhuǎn)染螢光素酶活性降低(P<0.05)，突變型Notch1質(zhì)粒中螢光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此可認(rèn)為miR-25能反向調(diào)控Notch1基因的表達。和正常對照組相比，實驗組小鼠海馬組織中miR-25表達量降低，Notch1、Hes5 mRNA和蛋白表達量均上升(P<0.05)；空載體組和模型組小鼠海馬組織中Notch1和Hes5基因表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，miR-25模擬物組小鼠海馬組織miR-25的表達增加，miR-25抑制劑組表達降低(P<0.05)；與模型組相比，miR-25模擬物組和DAPT組小鼠組織中Notch1和Hes5表達降低(P<0.05)，miR-25抑制劑組表達上升(P<0.05)；與miR-25抑制劑+DAPT組比較，單用miR-25抑制劑組小鼠海馬組織中Notch1和Hes5 mRNA表達升高，單用DAPT組則降低(P<0.05)。見圖1。

表2 miR-25和Notch1結(jié)合位點的3′UTR區(qū)序列Tab.2 Sequences of the 3′UTR region of Notch1 and miR-25 at binding site

注：A為螢光素酶活性，B為檢測目的基因的定量表達，C、D分別為Notch1和Hes5蛋白條帶結(jié)果及定量結(jié)果；(1)與正常對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與空載體組比較，P<0.05；(4)與miR-25模擬物組比較，P<0.05；(5)與miR-25 抑制劑組比較，P<0.05；(6)與DAPT組比較，P<0.05。圖1 各組小鼠海馬體各基因的表達Fig.1 The expression of indicated genes in mouse hippocampus in each group

2.2 學(xué)習(xí)和記憶容量

莫里斯水迷宮的測試結(jié)果表明，與正常對照組比較，其余各組小鼠的逃生潛伏期延長、經(jīng)過平臺次數(shù)減少(P<0.05)；和模型組比較，空載體組和miR-25抑制劑+DAPT組小鼠逃生潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，單用miR-25抑制劑組或單用DAPT組小鼠逃生潛伏期延長、經(jīng)過平臺次數(shù)減少(P<0.05)，miR-25抑制劑組表現(xiàn)相反(P<0.05)；與miR-25抑制劑組比較，miR-25抑制劑+DAPT組小鼠逃生潛伏期延長、經(jīng)過平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與DAPT組比較，miR-25抑制劑+DAPT 組小鼠逃生潛伏期縮短、經(jīng)過平臺次數(shù)增多(P<0.05)。見圖2。

注：A、B分別為莫里斯水迷宮中小鼠的逃生潛伏期和經(jīng)過平臺次數(shù)；(1)正常對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與空載體組比較，P<0.05；(4)與miR-25模擬物組比較，P<0.05；(5)與miR-25抑制劑組比較，P<0.05；(6)與DAPT組比較，P<0.05。圖2 各組小鼠莫里斯水迷宮的結(jié)果Fig.2 Results of Morris water maze in each group

2.3 SOD和MDA水平

與正常對照組比較，其余各組小鼠海馬組織SOD水平降低，MDA水平增高(P<0.05)；與模型組比較，miR-25模擬物組和DAPT組小鼠海馬CA1區(qū)SOD降低、MDA升高(P<0.05)，miR-25抑制劑組小鼠海馬CA1區(qū)SOD和MDA水平則增高，MDA水平降低(P<0.05)，空載體組和miR-25抑制劑+DAPT組小鼠海馬CA1區(qū)SOD和MDA水平比較、差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與miR-25抑制劑組比較，miR-25抑制劑+DAPT組小鼠海馬CA1區(qū)SOD水平降低、MDA水平升高；與DAPT組比較，miR-25抑制劑+DAPT組小鼠海馬CA1區(qū)SOD水平升高、MDA水平降低(P<0.05)。見圖3。

注：A、B分別為SOD和MDA定量結(jié)果；(1)與正常對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與空載體組比較，P<0.05；(4)與miR-25模擬物組比較，P<0.05；(5)與miR-25 抑制劑組比較，P<0.05；(6)與DAPT組比較，P<0.05。圖3 各組小鼠海馬體中SOD和MDA的表達Fig.3 The levels of SOD and MDA in the hippocampi in each group

2.4 COX-2、iNOS mRNA及蛋白質(zhì)的表達

相比于正常對照組，其他組小鼠海馬組織COX-2、iNOS 的mRNA及蛋白質(zhì)水平升高(P<0.05)；模型組和空載體組以及miR-25+DAPT組和模型組的COX-2、iNOS 的mRNA及蛋白質(zhì)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；和模型組相比，miR-25模擬物組和DAPT 組的COX-2、iNOS 的mRNA及蛋白質(zhì)表達水平上升(P<0.05)，但miR-25抑制劑組水平則下降(P<0.05)；和單用miR-25抑制劑相比，合用DAPT組的COX-2、iNOS mRNA及蛋白質(zhì)水平升高，但和單用DAPT相比，合用miR-25組的水平則降低(P<0.05)。見圖4。

注：A為COX-2和iNOS mRNA表達，B、C為COX-2和iNOS蛋白條帶結(jié)果和定量結(jié)果；(1)與正常對照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與空載體組比較，P<0.05；(4)與miR-25模擬物組比較，P<0.05；(5)與miR-25抑制劑組比較，P<0.05；(6)與DAPT組比較，P<0.05。圖4 各組小鼠海馬組織中COX-2、iNOS mRNA和蛋白表達Fig.4 mRNA and protein expression of COX-2 and iNOS in the hippocampus tissues in each group

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可能伴發(fā)有CNS感染，而感染的發(fā)展又和阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化及穩(wěn)態(tài)老化疾病的癥狀相關(guān)[16-18]。神經(jīng)炎癥是對生理紊亂的生物學(xué)反應(yīng)， 而CNS調(diào)控多種免疫反應(yīng)來恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[19]。然而，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病當(dāng)中神經(jīng)炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，可導(dǎo)致不可控的氧化應(yīng)激，對組織造成傷害，因此會破壞血腦屏障，引起繼發(fā)的腦組織損害[20-24]。目前CNS感染時腦組織中的分子保護機制仍不明確。

一些研究表明，腦缺血損傷時Notch1的表達量降低[25]。本研究用Notch信號通路抑制劑DAPT處理健康的雄性C57BL/6小鼠，結(jié)果表明抑制Notch信號通路可以加速具有認(rèn)知功能受損相關(guān)的CNS免疫炎癥小鼠的腦損傷。為了更進一步探究Notch信號通路的上游調(diào)控機制，本研究利用生信分析篩選出miR-25這一上游分子，雙螢光素酶實驗結(jié)果表明了miR-25對于Notch1表達的負(fù)向調(diào)控作用；實驗組小鼠分別注入miR-25模擬物、miR-25抑制劑以及miR-25抑制劑聯(lián)合DAPT后，結(jié)果顯示過表達miR-25可加速具有認(rèn)知功能受損相關(guān)的CNS免疫炎癥小鼠的腦損傷。因此，有理由認(rèn)為，miR-25通過靶向調(diào)控Notch1基因來抑制Notch信號通路，由此調(diào)控下游Hes5的表達并降低了CNS免疫炎癥小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶容量。

先前關(guān)于miR-25的研究均未涉及CNS感染，因此本研究重點關(guān)注了miR-25在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用。本研究結(jié)果顯示，SOD水平下降、MDA水平上升，且COX-2 及iNOS的水平上升，提示抑制Notch信號通路可阻斷miR-25，從而發(fā)起到腦損傷的保護作用。這些結(jié)果和之前的研究一致，表明Notch信號通路對于腦組織受損和氧化應(yīng)激小鼠認(rèn)知功能的保護作用，提示Notch信號通路可能是調(diào)控氧化應(yīng)激損傷中的關(guān)鍵因素[26-30]。

綜上，本研究表明miR-25通過靶向作用于Notch1基因介導(dǎo)的Notch信號通路，抑制了CNS感染小鼠腦損傷的恢復(fù)，這一結(jié)論進一步闡明了CNS疾病的發(fā)展機制，也為臨床治療CNS疾病奠定了理論基礎(chǔ)。然而，miR-25和CNS疾病的關(guān)系仍未完全闡明，miR-25抑制Notch1的分子機制還未詳細(xì)研究，需要更多的臨床研究進一步證實上述結(jié)果。