不同濃度七氟醚對心肌缺血再灌注大鼠心肌和神經組織損傷的影響及機制*

田杰， 米娜， 呂之勇， 楊春濤， 劉尊鴻

(1.荊門市第二人民醫院 麻醉科， 湖北 荊門 448000； 2.荊門市康復醫院 麻醉科， 湖北 荊門 448000)

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)是指冠狀動脈部分或完全急性阻塞后，在一定時間內重新獲得再通時，雖然缺血心肌獲得恢復正常灌注、但是心肌組織損傷反而呈現出進行性加重的病理過程[1]。MIR的缺血期可誘發心肌超危結構、心功能、能量代謝、電生理等一系列損傷性變化，因此血管再灌注后的表現突出、甚至可能誘發重度心律失常而導致患者猝死[2-3]。有學者對MIR犬模型進行探究，發現缺血前吸入最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration,MAC)異氟醚65 min后再洗出5 min，能夠發揮一定的心肌保護作用，減小心肌梗死面積，因此提出了麻醉藥預處理概念[4-5]。目前已有越來越多的臨床研究證實，吸入麻醉藥預處理對多種動物模型均有一定的作用，可減輕MIR損傷，減小心肌梗死面積[6-7]。MIR損傷發生后所導致的氧化應激反應會促進腎上腺興奮、促使機體各類炎性因子水平升高，參與機體應激狀態下認知功能的損害過程，因此MIR可能會損傷患者腦的認知功能[8-9]。七氟醚是臨床常用的吸入麻醉劑，能夠促進血管擴張、減少心肌氧化、抑制細胞凋亡，同時能夠激活線粒體通路，發揮腦組織保護效果[10-11]，但其濃度與S100鈣結合蛋白B(S100 calcium-binding protein B,S100B)、神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase ,NSE)等中樞神經細胞因子的關系還有待深入研究。因此，本研究探討不同濃度七氟醚對MIR大鼠S100B蛋白和NSE水平的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級健康雄性SD大鼠50只，3月齡，體質量為(204.38±5.94)g，購自南昌大學醫學院實驗動物中心[SYXK(贛)2015-0001]，所有大鼠分籠飼養在恒溫標準動物房，自由飲食、飲水，每日更換墊料，保持動物房清潔，適應性喂養1周。

1.1.2主要試劑與儀器 七氟醚(英國Abbott)，三苯基四唑氯化物(上海Abbott Laboratories S.A)，氯化鈉、戊巴比妥鈉、硫代巴比妥酸、黃嘌呤氧化酶、0.25%胰酶(上海麥克林生物)，酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosor-bent assay,ELISA)試劑盒(武漢默沙克生物)；麻醉氣體監測儀(深圳元特)，動物呼吸機(友誠生物)，組織切片機(杭州富陽康華)，高速組織搗碎勻漿機(上海舍巖)，流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特)。

1.2 研究方法

1.2.1造模 腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉。經口插入16 G動脈留置針管行機械通氣，設置潮氣量為3 mL，吸入氧濃度50%，使用燈泡加熱維持大鼠體溫為37 ℃，持續監測心電圖。常規備皮，使用碘伏消毒，大鼠采取平臥、稍向右側傾斜，依次打開心包膜，暴露心臟，明確冠狀動脈走向。對冠狀動脈進行結扎，心肌表現出紫紺、發白，心電圖出現ST段變化，提示MIR造模成功[12]；松開線結后心肌缺血區域紫紺消失，出現充血反應，再灌注2 h后，對大鼠手術野依次縫合，麻醉清醒后將其放回飼養箱內。最終成功構建MIR模型大鼠50只。

1.2.2分組及處理 50只MIR模型大鼠采用隨機數字表法分為模型組、1%七氟醚+O2組(A組)、2%七氟醚+O2組(B組)、3%七氟醚+O2組(C組)及4%七氟醚+O2組(D組)，每組10只。各組大鼠禁食8 h，置于麻醉誘導箱內，行MIR前按照2 L/min的體積流量吸入不同氣體6 h，模型組大鼠吸入O2、A組吸入1%七氟醚和O2、B組吸入2%七氟醚和O2、C組吸入3%七氟醚和O2、D組吸入4%七氟醚和O2；吸入氣體過程中持續使用烤燈加熱，確保大鼠肛門處溫度維持在(37.0±0.5)℃。

1.2.3心肌危險區和梗死區面積測量 “1.2.2”項下各組大鼠再灌注2 h，再次阻斷左前降支(left anterior descending，LAD)，取心臟安裝在Langendorff裝置上，鹽水持續沖洗1 min，分離左心室并稱重；左心室置于-20 ℃冰箱冷凍15 min，切成2 mm橫切片，使用含0.2 mmol/L 磷酸鹽(phosphate buffer solution，PBS)緩沖液的1%三苯基四唑氯化物37 ℃水浴切片5 min，取出觀察缺血梗死區域呈現蒼白色、缺血非梗死區域為紅色，分離缺血梗死區域、缺血未梗死區域及正常區域，并分別稱重，計算危險左心室面積(危險左心室面積=非梗死區面積+梗死區面積)和梗死面積(梗死面積=缺血梗死區重量/危險左心室面積重量)。

1.2.4血清炎性因子檢測 “1.2.2”項下各組大鼠再灌注2 h，抽取尾靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液，以ELISA試驗檢測血清核轉錄因子-kB(nuclear transcription factor kappa B,NF-kB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平。

1.2.5心肌組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonyl dialdehyde,MDA)檢測 取“1.2.3”項下各組大鼠左心室前壁心肌組織1 g，置于預冷的0.9 %氯化鈉溶液，制備10%的組織勻漿，分別使用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸顯色法測定心肌組織SOD活性和MDA活性。

1.2.6心肌損傷指標檢測 (1)心肌磷酸化蛋白激酶 B(phosphorylation of kinase B,p-Akt)、總蛋白激酶 B(total kinase B,t-Akt)表達量：取“1.2.3”項下各組大鼠左心室前壁心肌組織1 g提取組織蛋白，使用考馬斯亮藍染色法檢測蛋白含量。取蛋白樣品50 μg，電泳分離，使用半干轉移法使其置于硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane,NC)膜上，封閉2 h，依據1 ∶100配比加蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抗體，4 ℃過夜，使用PBS洗膜3 次、5 min/次，加二抗，置于37 ℃下反應2 h，PBS洗膜3次、5 min/次，顯色，使用電泳成像儀掃描獲得灰度值，記錄心肌p-Akt、t-Akt表達量。(2)B細胞淋巴瘤蛋白2(B cell lymphoma protein2,Bcl-2)表達量檢測：取“1.2.3”項下各組大鼠心肌組織切片置于烤箱內，60 ℃放置24 h，脫蠟至水；制備濃度為3%過氧化氫，室溫放置10 min，水洗3次、3 min/次；取0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，加熱至沸騰，10 min后再次加熱至沸騰，自然冷卻，洗3次、3 min/次；封閉20 min，去掉多余液體，加1 ∶100配比的兔抗鼠抗體，置于37 ℃保溫箱2 h，PBS洗3次、3 min/次；加山羊抗血清抗兔IgG，置于37 ℃保溫箱20 min，PBS洗3次，3 min/次；加鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)，置于37 ℃保溫箱20 min，PBS洗4次、3 min/次；使用蒸餾水洗滌殘留染色劑，加蘇木素復染，常規脫水封片，觀察。(3)心肌細胞凋亡率：取“1.2.3”項下各組大鼠心肌組織，使用0.25%胰酶處理心肌細胞，采用流式細胞儀測定凋亡心肌細胞。

1.2.7血流動力學指標檢測 “1.2.2”項下各組大鼠再灌注2 h后，采用動物無創血壓計BP-2006A測量心率(heart rate,HR)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)、心率與收縮壓乘積(rate-pressure product,RPP)水平。

1.2.8腦組織NSE、S100B蛋白檢測 取“1.2.3”項下各組大鼠腦組織勻漿，2 000 r/min離心5 min，取上清液置于-20 ℃冰箱。(1)酶法測定NSE：取出組織復溫，稀釋標本為100 μL，混勻覆膜，置于37 ℃下反應2 h，棄液體，甩干，加生物素標記抗體100 μL，置于37 ℃下反應1 h，重復上述操作1次；取辣根過氧化物酶工作液100 μL，置于37 ℃下反應1 h，棄液體，甩干，洗板5次，加洗滌緩沖液350 μL，甩干；取底物溶液90 μL加入各孔，置于37 ℃下避光顯色30 min，可見梯度藍色；各孔均加終止液50 μL，藍色轉變為黃色，15 min后使用酶聯儀測定各孔光密度(optical density,OD)值、乘稀釋倍數，得NSE濃度。(2)酶法測定S100B蛋白：取出酶法試劑盒，室溫下放置30 min，每孔均加標準品液體100 μL和酶標記溶液50 μL，封口，置于37 ℃恒溫箱內孵育1 h；沖洗酶標板5次，拍干，各孔內分別加顯色劑A 和顯色劑B各50 μL，避光15 min，加終止液50 μL，停止反應后測定OD值，繪制標準曲線，得S100B蛋白濃度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 心肌危險區和梗死區面積

各組大鼠心肌危險區域面積比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌梗死區域面積均減少，且隨著七氟醚濃度的升高而減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心肌危險區域和梗死區域面積Tab.1 Area of myocardial risk zone and infarct zone of

2.2 血清炎性因子水平

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠血清NF-kB、TNF-α及IL-6水平均降低，且隨著七氟醚濃度的升高而降低，差異均有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠血清炎性因子水平Tab.2 Levels of serum inflammatory factor of rats in each

2.3 心肌組織SOD和MDA水平

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠的心肌組織SOD水平升高，MDA水平降低，且隨著七氟醚濃度的升高SOD水平升高、A組B組>C組>D組，差異均有統計學意義(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠心肌組織SOD和MDA水平Tab.3 Levels of SOD and MDA in myocardial tissue of rats in each

2.4 心肌損傷指標

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌細胞凋亡率、p-Akt、t-Akt及Bcl-2水平均降低，且隨著七氟醚濃度的升高而降低，差異均有統計學意義(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠心肌損傷指標水平Tab.4 Levels of myocardial injury index of rats in each

2.5 血流動力學指標

模型組及A、B、C、D組大鼠HR、MAP、RPP水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05，表5)。

表5 各組大鼠血流動力學指標Tab.5 Hemodynamic index of rats in each

2.6 腦組織NSE和S100B蛋白水平

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠腦組織NSE、S100B蛋白水平均降低，且隨著七氟醚濃度的升高而降低，差異均有統計學意義(P<0.05，表6)。

表6 各組大鼠腦組織NSE和S100B水平Tab.6 Levels of NSE and S100B in brain tissue of

3 討論

目前臨床中常規心臟手術和移植期間，給予患者必要的缺血和再灌注能夠發揮一定的心臟保護作用，具有較佳的臨床意義，但這項措施也可能在一定程度上造成心臟功能障礙，表現為心肌輕度驚厥至心臟不可逆壞死，因此臨床上常使用鈣通道阻滯劑以減少缺血和再灌注損傷，近年來已經有大量研究顯示給予MIR患者缺血預處理可發揮內源性心臟保護機制[13-14]。綜合分析既往文獻中MIR的發生機制，認為MIR時活性氧生成增多，心肌細胞內鈣超載，再灌注誘發的炎癥介質和趨化因子及細胞凋亡等因素均為其發生機制[15-16]。因此目前臨床關注于緩解炎性反應、降低氧化應激反應來發揮心肌細胞保護效果及減少MIR所造成的損傷[17]。七氟醚常用于吸入和靜脈麻醉聯合的全身麻醉中，作用效果短，患者蘇醒快，且不會過度影響血流動力學，毒副效果小，且不同濃度的七氟醚對大鼠的記憶和認知功能均有一定影響，提示七氟醚可能對MIR有一定的作用，具有心肌保護和腦神經保護效果[18-19]。

本研究結果顯示，與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌梗死區域面積均縮小，血清NF-kB、TNF-α及IL-6水平均降低，后者為臨床常用的炎性指標，其水平升高提示機體呈現炎性反應，促進機體產生大量中性粒細胞，促進蛋白水解酶釋放和神經毒性物質的產生，對細胞膜造成損傷，進而導致心肌損傷；予MIR大鼠不同濃度七氟醚預處理后，大鼠體內的各炎性因子水平明顯降低，且隨著七氟醚濃度的升高炎性反應緩解效果更佳，避免了對心肌組織造成損傷，發揮了心肌保護效果[20-21]。

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌組織SOD水平升高，MDA水平降低。SOD和MDA含量變化能夠反映出組織氧化和損傷的程度，其中SOD具有抗氧化作用，其能夠對機體內自由基進行清除，而MDA則能夠反映脂質過氧化程度，可反映機體內自由基受共計的程度[22-23]，因此本結果提示七氟醚能夠降低MDA活性，提高SOD活性，提示其發揮了較佳的心肌保護作用。

此外，與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌細胞凋亡率、p-Akt、t-Akt及Bcl-2水平均降低，腦組織NSE、S100B蛋白水平均降低，且呈現劑量反應。有研究顯示，異丙酚可激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K)-Akt信號通路來發揮心肌細胞保護作用，其中Akt為該信號通路中的一員，Bcl-2為其靶分子，具有抗凋亡，促進細胞存活的功效[24]。本研究中給予MIR模型大鼠七氟醚也取得了相似的結果，提示七氟醚可能通過激活PI3K-Akt信號通路發揮了抗心肌細胞凋亡和心肌保護的效果。NSE為臨床常用的腦損傷標志物，其水平越高提示腦組織損傷越重；S100B為腦特異性蛋白，其能夠調節腦細胞能量代謝，當出現腦損傷時腦神經細胞損壞，釋放S100B，導致腦組織內其含量升高[25]。本研究中給予MIR模型大鼠七氟醚后抑制了鈣離子流入腦組織，減輕了神經元鈣超載，修復了顱腦損傷，且七氟醚具有抗氧自由基功能，可改善腦組織微循環、提高局部血流、緩解腦水腫、降低腦代謝率，進而發揮了腦組織保護效果，調控了NSE和S100B蛋白的含量。

本研究中雖然不同濃度的七氟醚對MIR模型大鼠均發揮了一定的作用，但隨著七氟醚濃度的升高作用效果越顯著，呈現一定劑量反應，因此將七氟醚應用于MIR中的最佳濃度仍需要進一步探究，以發揮最佳效果。

綜上所述，不同濃度七氟醚均能夠改善MIR大鼠的炎性反應，緩解氧化應激反應，減少心肌損傷，縮小心肌梗死面積，保護大腦神經功能，且隨著七氟醚的作用效果呈現劑量反應，隨著濃度的升高而作用顯著。