皮膚黑色素瘤組織中Nedd4L與Cbl-b蛋白的表達及對患者預后的評估價值*

馮浩， 代雅玲， 章君儀， 陳夢嬌， 彭世雄， 唐樺， 高麗娜， 譚文， 賈曉敏

(1.湖南師范大學第一附屬醫院 & 湖南省人民醫院 皮膚科， 湖南 長沙 410005； 2.中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院 病理科， 湖南 長沙 410013； 3.長沙市第八醫院 病理科， 湖南 長沙 410100； 4.拉薩市人民醫院 病理科， 西藏 拉薩 850000)

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)屬于高度惡性腫瘤，是由皮膚組織及黏膜黑色素細胞惡性分化而成，占皮膚腫瘤死亡病例的絕大部分，預后較差[1-2]。近年來我國CMM的發病率呈明顯上升趨勢[3-4]，盡管對CMM的臨床研究較多，但其發病機制尚不明確。有文獻報告惡性腫瘤的發生、發展與泛素連接酶的表達密切相關，可通過檢測泛素連接酶的表達量來判斷腫瘤的預后[5-6]。神經前體細胞表達發育調控樣蛋白(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4-like，Nedd4L)是早期胚胎神經系統發育下調基因，屬于泛素連接酶Nedd4家族成員[7]，Nedd4L已被證明在前列腺癌、非小細胞肺癌、膽囊癌、胃癌、惡性膠質瘤及結腸直腸癌等腫瘤的預后中發揮關鍵作用[8]。環指型泛素連接酶(asitasb-lineage lymphoma-b，Cbl-b)是Cbl家族成員之一，屬于環指型E3泛素連接酶，在腫瘤發病中可通過其N-端酪氨酸激酶結合(tyrosine kinase binding，TKB)結構域識別并結合底物蛋白酪氨酸激酶，從而啟動底物泛素化降解，參與細胞內信號轉導的負向調控[9-10]；研究發現Nedd4L和Cbl-b的表達與CMM密切相關[11-12]，但缺乏同時檢測2種指標表達與CMM發生發展之間的關系研究。因此，本研究探討Nedd4L與Cbl-b在CMM中的表達情況，并分析其臨床意義，現將結果匯報如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年2月—2018年2月就診的CMM患者作為CMM組，要求病理檢查符合CMM診斷標準[13-14]，且入組前未接受過手術、化療及激光治療等；排除感染性疾病、急慢性肝腎功能不全、結締組織病變、自身免疫疾病等。共納入CMM組患者40例，男25例、女15例，年齡24～78歲、平均(52.2±3.8)歲，病程6個月～15年、平均(6.8±1.2)年，發生于四肢、胸背部、外陰部及面頰部分別為12例、8例、10例及10例，無轉移CMM 25例、有轉移CMM 15例，CMM的臨床分期分0期(原位癌)12例、Ⅰ～Ⅱ期(腫瘤細胞局限無轉移)8例、Ⅲ期(腫瘤發生區域轉移，但仍局限于皮膚內)10例及Ⅳ期(腫瘤已發生遠處轉移)10例，腫瘤潰瘍20例、無腫瘤潰瘍20例。所有CMM組患者均有較完整的病歷資料，并且通過電話隨訪患者預后，并簽署知情同意書。同時收集良性痣患者50例為對照組，男32例、女18例，年齡18～72歲、平均(51.9±3.2)歲，皮內痣21例、交界痣19例及混合痣10例。收集2組患者病理科存檔蠟塊及隨訪情況。

1.2 研究方法

1.2.1鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase，SP)檢測組織中Nedd4L、Cbl-b表達 取2組患者病變組織切片標本，采用無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各浸泡30 min；酒精脫水，透明劑、脫水劑與石蠟混合，無水乙醇 ∶二甲苯(1 ∶1)與二甲苯Ⅰ各10 min，二甲苯Ⅱ7 min；組織透明后，采用石蠟Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ于60 ℃依次浸蠟1 h；先將蠟塊冷凍5 min，采用KD202A病理切片機(金華科迪儀器設備有限公司)切片，依次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ、10 min/次，加無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ、5 min/次，加95%和70%酒精、3 min/次；蒸餾水浸洗2 min；組織切片采用蘇木素染液進行染核，沖洗；依次加適量無水乙醇Ⅰ、Ⅱ及二甲苯Ⅰ、Ⅱ，5 min/次；切片風干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Nedd4L以胞漿或細胞膜出現黃色顆粒狀物質為陽性表達、也可在CMM細胞核中少量表達為陽性，Cbl-b表達以胞漿或細胞膜中出現棕黃色顆粒為陽性細胞；染色切片由高年資醫師采用雙盲法進行診斷及染色，每張切片隨機選取5個高倍視野(200倍)，每個高倍視野以50個腫瘤細胞進行計數。

1.2.2染色結果判斷 根據細胞染色強度及染色密度判斷染色結果，均采用4級評分，染色強度規定不著色、呈淡黃色、棕黃色及棕褐色分別計為0、1、2及3分，染色密度規定著色細胞比例<5%、5%～25%、26%～50%及>50%分別計為0(陰性)、1、2及3分，染色強度和染色密度乘積得分即得染色結果；乘積得分≤2分、3～6分及>6分別定義為陰性(-)、陽性(+)及強陽性(++)表達，同時計算蛋白表達率(蛋白表達率=陽性表達例數/總例數×100%)[15]。

1.2.3隨訪資料收集 通過查閱病歷并進行隨訪，收集CMM組患者性別、年齡、腫瘤部位、有無發生轉移、臨床分期、腫瘤潰瘍、腫瘤厚度等一般臨床資料，隨訪3年內生存時間。

1.3 統計學分析

應用SPSS 19.0進行統計學分析，計數資料數據采用頻數、百分比表示，應用χ2檢驗及Fisher確切概率法比較組間差異，兩兩比較P值采用0.05/6=0.008作為校正標準；采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析Nedd4L、Cbl-b單一和聯合檢測對CMM組患者預后的預測價值；P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Nedd4L和Cbl-b蛋白的表達

結果顯示，Nedd4L蛋白在CMM組患者病理切片組織中呈強陽性表達、對照組中呈弱陽性表達，Cbl-b在CMM組和對照組患者組織中分別呈陽性和陰性表達；χ2檢驗結果顯示，CMM組患者組織中Nedd4L、Cbl-b蛋白陽性表達率均高于對照組患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 CMM組和對照組患者病理切片組織中Nedd4L和Cbl-b的表達(SP，×200)Fig.1 Expression of Nedd4L and Cbl-b in control group and CMM group(SP，×200)

2.2 不同臨床分期CMM患者病理切片組織中Nedd4L和Cbl-b表達

χ2檢驗結果顯示，CMM組不同臨床分期患者病理切片組織中Nedd4L和Cbl-b的陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床分期CMM組患者的Nedd4L和Cbl-b陽性表達[n(%)]Tab.2 Positive expression of Nedd4L and Cbl-b in CMM patients with different clinical stages[n(%)]

2.3 CMM組患者隨訪期間的死亡情況

隨訪結果顯示，CMM組患者死亡21例、死亡率為52.50%(21/40)；CMM組患者年齡越大、腫瘤潰瘍、腫瘤發生轉移、臨床分期越晚、腫瘤厚度越厚、Nedd4L及Cbl-b陽性表達是導致CMM預后較差的關鍵因素(P<0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征CMM組患者死亡率比較[n(%)]Tab.3 Comparison of mortality rate of CMM patients with different clinical features[n(%)]

2.4 Nedd4L和Cbl-b指標評估CMM患者預后的價值

ROC分析可知，Nedd4L和Cbl-b表達在CMM組患者死亡率診斷中曲線下面積(area under curve，AUC)均>0.5，提示Nedd4L、Cbl-b表達在CMM組患者死亡率診斷中有一定的應用價值；各指標Youden指數最大值所對應的變量值獲得最佳臨界點，確定Nedd4L、Cbl-b在CMM患者預后中的診斷值，Nedd4L聯合Cbl-b對CMM患者預后的判斷和特異性均高于單一指標(P<0.05)。見表4。

表4 Nedd4L和Cbl-b檢測對CMM患者預后的評估價值Tab.4 Evaluating value of Nedd4L and Cbl-b in prognosis of patients with CMM

3 討論

CMM是一種發病率高、惡性程度高、預后差等特點的惡性腫瘤，目前CMM治療仍以手術為主，化療、放療、靶向治療及免疫治療在臨床上也有廣泛應用[16]，但不同年齡、發病部位、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度及手術切除范圍的患者預后效果存在明顯的差異[17-18]。

Nedd4L和Cbl-b是E3泛素連接酶家族成員，參與細胞周期的調控、凋亡、炎癥反應、氧化應激反應、基因轉錄、信號轉導以及藥物抵抗等重要過程[19-20]。Nedd4家族成員具有獨特的模塊結構域結構，氨基末端C2鈣依賴性磷脂結合結構域和蛋白與蛋白相互作用的2～4個WW結構域和羧基末端HECT泛素連接酶結構域[21]。E3泛素連接酶可與底物蛋白直接或間接結合并決定蛋白泛素化特異性，泛素化降解蛋白在調控細胞生命活動過程中起到重要作用，因此，確保蛋白質泛素化過程有序正常維持對維持細胞生命活性有重要的意義，其異常表達與腫瘤發生及進展密切相關[22-25]。

Cbl-b是建立T細胞激活閾值和通過各種機制調節外周T細胞耐受必不可少的關鍵因子[26]。有研究表明，Cbl-b也可調節先天免疫反應，并在宿主對病原體的防御和抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用[27]。Cbl-b缺失會導致T淋巴細胞免疫調控缺陷，并會導致自發性或誘導性自身免疫反應[23]。在腫瘤浸潤淋巴細胞中可存在Cbl-b過表達情況，從而影響腫瘤免疫耐受性。

本研究結果表明Nedd4L、Cbl-b陽性表達與CMM的發生及病情進展有密切的關系，其中對相關病理標本進行免疫組織化學分析結果顯示，CMM組患者組織中Nedd4L、Cbl-b蛋白表達水平高于對照組；對CMM患者進行3年隨訪觀察結果顯示，CMM組患者死亡率為52.05%；對影響CMM患者死亡的相關因素分析，結果顯示，腫瘤潰瘍、腫瘤發生轉移、臨床分期、腫瘤厚度、Nedd4L及Cbl-b陽性表達是CMM患者預后的獨立危險因素，這表明Nedd4L及Cbl-b陽性表達除了與CMM進展有關外，還與CMM患者預后有著密切聯系。本研究采用ROC曲線分析，Nedd4L、Cbl-b在CMM患者預后中的診斷價值，結果顯示，Nedd4L聯合Cbl-b對CMM患者預后的診斷靈敏性、特異性高于單一指標，表明Nedd4L、Cbl-b可作為評價CMM病情進展及預后的預測指標。

綜上，Nedd4L、Cbl-b陽性表達與CMM發生及病情進展有密切關系。腫瘤潰瘍、腫瘤發生轉移、臨床分期、腫瘤厚度、Nedd4L及Cbl-b陽性表達是影響CMM患者預后的獨立危險因素；Nedd4L、Cbl-b可作為CMM患者預后的評價指標，且聯合應用可提高CMM患者預后評價的準確性及靈敏性，可為CMM預后預測的評價指標。