QuEChERS-UPLC-MS/MS法快速測定水產品中氯霉素

常 波

（營口市農業農村綜合發展服務中心（營口市農產品質量安全檢驗監測中心），遼寧營口 115004）

氯霉素類（Chloramphenicol，CAP）是一種人工合成的廣譜抗生素，價格便宜、抑菌性強、體內吸收良好，被廣泛應用于水產動物的疾病防控[1]。這些藥物一般較穩定，不易降解，在水產品中殘留可通過食物鏈進入人體，氯霉素能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥、新生兒灰色綜合征等疾病，尤其是氯霉素的低濃度藥物殘留會誘發致病菌的耐藥性[2]。氯霉素的殘留不但對人體造成危害，還會嚴重影響我國動物性食品的出口。我國在水產品養殖過程中禁止添加或使用氯霉素，2019年農業農村部發布了動物食品中禁止使用的藥品及其他化合物清單，規定在動物食品中不得檢出氯霉素[3]。

目前的標準前處理方法需要反復提取和氮吹濃縮吹干，前處理時間長，難以滿足批量水產品中氯霉素殘留量的快速篩查。QuEChERS是由美國化學家Lehotay和德國的Anastassiadas于2003年提出的一種快速（Quick）、簡便（Easy）、便宜（Cheap）、有效（Effectiv）、可靠（Rugged）及安全（Safe）的樣品處理技術[4-6]，最早在農藥多殘留中使用。因此本方法采用Simle-QuEchERS Nano-Ant快速測定水產品中的氯霉素殘留量。這樣操作既簡單快速，又能保證檢測的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚，購買于營口市某農貿市場；氯霉素（CAP，99.8%）、氯霉素氘代物（CAP-D5，100 μg·mL-1），購自MedJen；甲醇、乙腈（色譜純，德國Meker公司）；QuEChERS-SPE抗生素凈化小柱含鹽包 4.0 g無水硫酸鎂（MgSO4），1.0 g氯化鈉，陶瓷均質子（LUMTECH）；試驗用水均為超純水。

Aglient超高效液相色譜-質譜三重四極桿聯用儀6460（配有EI離子源）；分析天平（感量0.01 g、0.00 001 g，瑞士Mettle Toledo公司）；渦旋振蕩器（德國Heidolph）；1 000 μL移液槍（德國艾本德）；冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientifi）；全自動氮吹濃縮儀N1（上海屹堯Preekem）；Milli-Q Advamtage超純水器（美國Millipore）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取勻漿樣品5.0 g（準確至±0.02 g），加CAP-D5內標工作液250 μL，于50 mL具塞離心管中；加入 4.0 mL超純水和10 mL乙腈，渦旋5 min，加入4.0 g無水硫酸鎂（MgSO4），1.0 g氯化鈉（NaCl）及一顆陶瓷均質子，渦旋1 min；4 ℃下離心，10 000 r·min-1， 5 min；取一支Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素凈化柱垂直塞入50 mL具塞離心管中，緩慢下壓凈化柱頂部，上層清液隨壓力，自下而上進入凈化柱儲液槽內；使用移液槍至凈化柱儲液槽內，吸取2 mL上清液于 40 ℃水浴中氮氣吹至近干，1 mL流動相定容；過0.22 μm有機微孔濾膜至進樣瓶，LC-MS/MS待測定。

1.2.2 標準曲線制備

用乙腈將氯霉素配制成10 ng·mL-1、50 ng·mL-1的標準中間液和將氘代氯霉素配制成20 ng·mL-1的標準中間作液。分別精確量取10 ng·mL-1標準液0.050 mL、0.100 mL和50 ng·mL-1標 準 液0.040 mL、0.100 mL、 0.200 mL，再分別加入0.250 mL濃度為20 ng·mL-1的氘代氯霉素內標溶液，用20%的乙腈溶液稀釋成氯霉素濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和 10.0 ng·mL-1、內標CAP-D5濃度為5.0 ng·mL-1的標準溶液，供液相色譜法-串聯質譜法測定。以測得特征離子質量色譜峰外標和內標峰面積比為縱坐標、對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

1.2.3 儀器條件

（1）色 譜 條 件。色 譜 柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；柱溫： 30 ℃；進樣量：20 μL；流速：0.35 mL·min-1；流動相為乙腈-水進行梯度洗脫見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

（2）質譜MS條件。負離子電噴霧ESI-多反應監測（MRM）模式；掃描方式：負離子；毛細管電壓：4 000 V；霧化氣壓力（GSI）：40 psi；氣流溫度：350 ℃；鞘氣流速：9 L·min-1。氯霉素的MRM模式定性定量分析參數見表2。

表2 氯霉素MRM模式定性定量分析參數表

2 結果與分析

2.1 樣品前處理優化

本方法考察了水產品前處理中加入甲醇、乙腈對氯霉素類藥物的提取率的影響[7]，乙腈可避免提取脂肪，同時又能沉淀蛋白質，可提高氯霉素提取率，因此本方法采用加入超純水和乙腈進行提取，再加入鹽包（4.0 g無水硫酸鎂，1.0 g氯化鈉）進行鹽析除蛋白和脫水，脫水會減少氮吹時間，提升檢測效率，用Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素凈化柱進行凈化，代替正己烷除脂和通常用的SPE小柱凈化，此QuEchERS小柱操作步驟快速簡單，免去繁雜的提取步驟，節省前處理時間。

2.2 工作曲線線性范圍

以氯霉素濃度為橫坐標，以氯霉素峰面積與CAP-D5峰面積比值為縱坐標，得到其線性方程為y=0.988 640x-0.017 632（R2=0.999），氯霉素在0.5～ 10 ng·mL-1時，線性關系良好。空白鯉魚肉中添加 1.0 μg·kg-1氯霉素和CAP-D5MRM色譜圖見圖1。

圖1 空白鯉魚肉中添加1.0 μg·kg-1氯霉素和CAP-D5的MRM色譜圖

2.3 方法回收率和精密度

在5.0 g空白鯉魚肉中添加3個低、中、高的濃度水平標準溶液，添加濃度分別為10 ng·mL-1氯霉素標準溶液0.1 mL，50 ng·mL-1氯霉素標準溶液 0.1 mL，0.5 μg·mL-1氯霉素標準溶液0.1 mL，20 ng·mL-1CAP-D5標準中間液250 μL，添加濃度水平分別為 0.2 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1，添加的CAP-D5濃度為5.0 ng·mL-1，每個添加水平做6個平行，按照1.2.1前處理的方法進行處理，測定氯霉素峰響應值的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD），計算方法的回收率和精密度。由表3知，3個添加水平的平均回收率為100%～115%，精密度為3.6%～10.0%，滿足測定要求。

表3 方法回收率和精密度RSD結果表（n=6）

3 結論

對氯霉素的標準方法進行優化，用水和乙腈進行提取，Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素凈化柱進行凈化，代替標準中乙腈和乙酸乙酯反復提取和正己烷除脂，減少前處理的時間，提升檢測效率。并加入CAP-D5作為內標進行檢測，一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。此QuEChERS方法操作簡單、靈敏度高、結果準確，并且回收率和精密度滿足測定要求，適合大批量水產品中氯霉素的殘留量篩查。