血清miR-4463和miR-1293表達水平預測結(jié)腸癌術后預后不良的臨床價值

張 嘯，李 濤，鄭 植，陳鑫源，陸 江

1.上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院普外科，上海 201803；2.江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院普外科，江蘇常州 213300

結(jié)腸癌是外科的常見惡性腫瘤，位居城市居民腫瘤發(fā)病率的第2位，病死率的第4位。結(jié)腸癌的早期常常無特異性癥狀，多數(shù)患者在確診時均已經(jīng)處于中晚期，術后5年生存率仍較低[1]。全球每年新發(fā)結(jié)腸癌患者在120萬例以上，而約有60萬例患者死于結(jié)腸癌[2]。我國結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年升高，目前臨床上仍缺乏對結(jié)腸癌診斷和預后判斷的敏感指標[3]，因此，探索靈敏度較高的結(jié)腸癌診斷和預后判斷指標具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是單鏈非編碼RNA，與靶基因具有結(jié)合位點，對靶基因具有調(diào)控作用，參與腫瘤細胞的增殖和遷移等生物學功能[4]。本研究通過檢測結(jié)腸癌患者血清miR-4463和miR-1293表達水平，分析二者在結(jié)腸癌預后判斷中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2021年12月上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院(25例)和江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院(90例)收治的115例結(jié)腸癌手術患者納入結(jié)腸癌組，其中男65例，女50例；年齡35～79歲，平均(53.85±15.12)歲；有飲酒史21例，無飲酒史94例；有吸煙史27例，無吸煙史88例；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(23.79±3.28)kg/m2。選擇同期65例在上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院(5例)和江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院(60例)進行結(jié)腸良性疾病手術治療患者納入良性疾病組，其中男34例，女31例；年齡31～77歲，平均(52.94±11.00)歲；有飲酒史3例，無飲酒史34例；有吸煙史26例，無吸煙史39例；BMI為(22.48±4.10)kg/m2。納入標準：所有患者均進行病理學檢查確診，結(jié)腸良性疾病均為結(jié)腸腺瘤；結(jié)腸癌患者均為首次發(fā)病，術前沒有接受過放化療。排除標準：合并其他部位惡性腫瘤；患者有手術禁忌證或者不愿意接受手術；合并血液性和免疫性疾病；結(jié)直腸有急慢性感染；存在心、肝、腎等重要臟器功能不全；合并高血壓、糖尿病、冠心病等慢性疾病；存在智力障礙或者精神疾病。選擇同期30例在上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院進行健康體檢的健康者納入健康對照組，其中男17例，女13例；年齡36～80歲，平均(53.07±11.92)歲；有飲酒史14例，無飲酒史16例；有吸煙史17例，無吸煙史13例；BMI為(23.63±3.38) kg/m2。3組研究對象年齡、性別、BMI等基線資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書，并經(jīng)兩家醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1癌胚抗原(CEA)檢測 結(jié)腸癌和結(jié)腸良性疾病患者入院時，結(jié)腸癌患者術后7 d，健康對照組在門診體檢時均抽取清晨空腹靜脈血約5 mL，在室溫下靜置30 min后，用離心機分離上層血清放置在-80 ℃的冰箱中待測。采用全自動化學發(fā)光儀(Cobas e601型，羅氏公司，化學發(fā)光微粒子免疫檢測法)對CEA進行檢測，試劑盒為博奧生物有限公司產(chǎn)品。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) 結(jié)腸癌和結(jié)腸良性疾病患者入院時，結(jié)腸癌患者術后7 d，健康對照組在門診體檢時均采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集外周靜脈血3 mL，放置在-80 ℃的冰箱中待檢。采用Trizol試劑(碧云天生物技術有限公司)提取血清總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Sigma公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并放置在-20 ℃的冰箱中保存。然后采用熒光染料法以cDNA為模板在IQ5 RT-PCR上進行擴增。采用Primer express 3.0軟件設計合成引物探針，由上海英駿生物技術有限公司合成。miR-4463的正向引物為5′-GGCCCACCCCAGTCTC-3′；反向引物為5′-GCAGGAGACTGGGGTG-3′。miR-1293的正向引物為5′-CCTGCCGGGGCTAAAGTGCTG-3′；反向引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。U6的正向引物為5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAA TTGGAA-3′；反向引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。采用PCR儀[美谷分子儀器(上海)有限公司，ABI 7900型]進行檢測，采用20 μL PCR擴增反應體系，其組成為引物1 μL，cDNA 1 μL，TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL，加入雙蒸餾水補充至20 μL。通過如下循環(huán)：預變性5 min，預變性溫度調(diào)節(jié)為95 ℃，之后在95 ℃條件下變性15 s，然后在60 ℃的條件下進行退火，時間為30 s，之后在72 ℃條件下延長1 min，總共40個循環(huán)，最終采用循環(huán)閾值法定量分析miR-4463和miR-1293的表達水平，以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計算miR-4463、miR-1293相對表達量。

1.3觀察指標 觀察各組血清miR-4463、miR-1293和CEA表達水平的變化，對結(jié)腸癌患者發(fā)生預后不良的相關影響因素進行單因素和多因素分析，分析血清miR-4463、miR-1293和CEA表達水平在預測結(jié)腸癌術后預后不良中的效能。

2 結(jié) 果

2.1各組3項指標表達水平比較 結(jié)腸癌組入院時miR-4463和CEA表達水平明顯高于良性疾病組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；良性疾病組的miR-4463表達水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。良性疾病組的CEA水平與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)腸癌組術后7 d血清miR-4463和CEA表達水平分別為1.75±0.56、(1.76±0.54)ng/mL，二者均較入院時明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)腸癌組入院時miR-1293表達水平明顯低于良性疾病組和健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；良性疾病組miR-1293表達水平明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)腸癌組術后7 d血清miR-1293表達水平為4.52±1.18，較入院時明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2結(jié)腸癌術后預后不良的單因素分析 所有結(jié)腸癌患者均隨訪3～36個月，平均(22.24±4.06)月，其中25例出現(xiàn)死亡，納入預后不良組，90例至隨訪結(jié)束時仍生存納入預后良好組。預后不良組與預后良好組性別、年齡和腫瘤部位構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而兩組腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期構(gòu)成比及miR-4463、miR-1293、CEA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3結(jié)腸癌術后預后不良的多因素分析 將2.2中單因素分析差異有統(tǒng)計學意義的指標(腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期及miR-4463、miR-1293、CEA表達水平)作為自變量，將是否發(fā)生預后不良作為因變量，進行二元Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤分期為Ⅲ期，miR-4463和CEA表達水平升高，以及miR-1293表達水平降低均是結(jié)腸癌術后預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表1 各組3項指標表達水平的比較

2.43項指標檢測預測結(jié)腸癌術后預后不良的效能 血清miR-4463和miR-1293表達水平預測結(jié)腸癌術后預后不良的曲線下面積(AUC)明顯大于CEA(P<0.05)。根據(jù)是否發(fā)生預后不良擬合二元Logistic回歸方程Y=1.35XmiR-4463-2.45XmiR-1293-1.92，得到聯(lián)合檢測指標，聯(lián)合檢測預測結(jié)腸癌術后預后不良的靈敏度為96.0%，特異度為78.9%，AUC為0.930，AUC明顯大于miR-4463(Z=2.221，P<0.05)和miR-1293(Z=2.680，P<0.05)單獨檢測，而兩項指標單獨檢測的AUC比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4和圖1。

2.5結(jié)腸癌患者血清miR-4463和miR-1293表達水平的相關性分析 結(jié)腸癌患者血清miR-4463表達水平與miR-1293表達水平呈負相關(r=-0.728，P<0.05)。

表2 結(jié)腸癌術后預后不良的單因素分析 (n或

表3 結(jié)腸癌術后預后不良的多因素分析

表4 血清miR-4463、miR-1293和CEA檢測預測結(jié)腸癌術后預后不良的效能

圖1 不同指標預測結(jié)腸癌術后預后不良的ROC曲線

3 討 論

雖然結(jié)腸癌的治療方法不斷改進，但術后仍有不少患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復發(fā)，嚴重影響結(jié)腸癌患者的預后[5]。隨著對結(jié)腸癌分子機制研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)靶向藥物能夠在一定程度上改善患者的預后[6]。腫瘤分期高、分化程度低和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者預后不良的危險因素，但結(jié)腸癌具有明顯的異質(zhì)性，即使相同腫瘤分期的患者對同樣治療方案的敏感性也不一樣，部分患者甚至存在治療抵抗[7-8]。因此，尋找預測結(jié)腸癌預后的指標對于進一步優(yōu)化結(jié)腸癌治療方案具有重要的臨床價值。本研究結(jié)果顯示，預后不良組與預后良好組性別、年齡和腫瘤部位構(gòu)成比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而兩組腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期構(gòu)成比及miR-4463、miR-1293和CEA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步進行多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤分期為Ⅲ期，miR-4463和CEA表達水平升高，以及miR-1293表達水平降低均是結(jié)腸癌術后預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。同時進行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-4463和miR-1293在預測結(jié)腸癌術后預后不良中的效能明顯優(yōu)于CEA。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組入院時血清miR-4463表達水平明顯高于良性疾病組和健康對照組，并且結(jié)腸癌組術后 7 d血清miR-4463表達水平較入院時明顯降低，說明miR-4463參與了結(jié)腸癌疾病的發(fā)生、發(fā)展。miR-4463是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，現(xiàn)已知其與細胞增殖和侵襲關系密切，最早發(fā)現(xiàn)其主要在血管閉塞性疾病中能夠抑制低密度脂蛋白誘導平滑肌的遷移，機制可能為通過靶向調(diào)控下游人血管肌的基因，從而達到對血管平滑肌的調(diào)控[9-10]。而miR-4463在癌癥中的研究仍比較少，一項關于肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，在甲胎蛋白水平?jīng)]有升高前，肝癌患者血清中miR-4463表達水平已出現(xiàn)明顯升高，并且高表達miR-4463患者術后生存期明顯縮短，認為miR-4463是肝癌預后不良的潛在指標[11]。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中miR-4463表達水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織，在結(jié)腸癌細胞體外研究中發(fā)現(xiàn)miR-4463具有促進結(jié)腸癌細胞增殖、遷移和抑制細胞凋亡的作用，并認為miR-4463可能成為預測結(jié)腸癌預后的潛在指標[12]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-4463表達水平升高是結(jié)腸癌術后預后不良的獨立危險因素，對于miR-4463表達水平升高的患者是否需要采取進一步治療措施仍需深入研究明確。本研究結(jié)果顯示，當血清miR-4463為4.17時，其預測預后不良的靈敏度為72.0%，特異度為87.8%，AUC為0.856，說明血清miR-4463檢測預測結(jié)腸癌術后預后不良具有較高的效能。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組入院時血清miR-1293表達水平明顯低于良性疾病組和健康對照組，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組術后7 d血清miR-1293表達水平較入院時明顯升高，說明miR-1293參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，miR-1293基因是結(jié)腸癌的抑癌基因。miR-1293基因位于12q1312染色體上，目前，對miR-1293基因在癌癥中的生物學行為研究結(jié)論存在爭議。在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌組血清miR-1293表達水平明顯高于對照組，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤浸潤程度關系密切，血清miR-1293表達水平與肺腺癌患者的生存期明顯相關，在肺腺癌中miR-1293基因表現(xiàn)為促癌基因[13-14]；而在三陰乳腺癌中，miR-1293則起到抑癌基因的作用，可抑制乳腺癌的增殖和遷移[15]，說明miR-1293基因的功能具有一定的組織依賴性。本研究結(jié)果還顯示，血清miR-1293表達水平升高是結(jié)腸癌術后預后不良的獨立保護因素，并且發(fā)現(xiàn)當血清miR-1293為1.86時，其預測預后不良的靈敏度為84.0%，特異度為73.3%，AUC為0.826，說明血清miR-1293檢測在預測結(jié)腸癌術后預后不良中具有較高的效能。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-1293和miR-4463檢測聯(lián)合預測結(jié)腸癌術后預后不良的靈敏度為96.0%，特異度為78.9%，AUC為0.930，其AUC明顯大于miR-1293和miR-4463單獨檢測，說明二者在預測結(jié)腸癌術后預后不良中具有一定互補性，確切的機制需要進一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-1293表達水平與miR-4463表達水平呈負相關，說明miR-1293基因在結(jié)腸癌中表現(xiàn)為抑癌基因，而miR-4463基因在結(jié)腸癌中表現(xiàn)為促癌基因，在人體中二者存在某種平衡，若該平衡出現(xiàn)紊亂會導致腫瘤的發(fā)生，其具體機制需要進一步研究。

綜上所述，miR-4463和miR-1293參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，血清miR-4463和miR-1293是結(jié)腸癌術后預后的獨立影響因素，在預測不良預后中具有較高的效能。