2015—2020年某院CRE分布、耐藥性及碳青霉烯酶基因檢測結果分析

黃加銘，王 啟，徐玉金，孫細歡，黃東紅△

1.福建醫科大學附屬第二醫院微生物實驗室，福建泉州 362300;2.北京大學人民醫院檢驗科，北京 100044

近年來，碳青霉烯耐藥的革蘭陰性菌，尤其是碳青霉烯耐藥腸桿菌(CRE)在全球范圍內迅速增長，已經成為一個嚴重的全球性公共衛生問題。根據美國疾病控制與預防中心(CDC)的數據，CRE耐藥率在過去十年中從1.2%上升到了4.2%[1-2],根據中國抗菌藥物監測網(CHINET,www.chinets.com)的數據，肺炎克雷伯菌對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別從2005年的2.9%和3.0%迅速上升至2018年的26.3%和25.0%，2019—2021年的耐藥率均高于23.0%。相關研究已經證明，碳青霉烯酶基因(包括blaKPC-2和blaNDM)的存在是中國CRE對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制，分別以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌最多見[3]。本研究對2015—2020年福建醫科大學附屬第二醫院(以下簡稱本院)臨床分離的CRE菌株進行耐藥性、臨床分布、主要碳青霉烯酶基因型等分析，旨在為本地區CRE感染治療和流行控制提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1月1日至2020年12月31日本院臨床分離的對厄他培南、美羅培南或亞胺培南任意一種藥物耐藥的非重復性CRE 38株，包括肺炎克雷伯菌15株，大腸埃希菌13株，陰溝腸桿菌3株，黏質沙雷菌3株，解鳥氨酸拉烏爾菌2株，產酸克雷伯菌1株，植生拉烏爾菌1株。培養操作嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》[4]進行。

1.2儀器與試劑 microflex LRF MALDI-TOF型質譜微生物鑒定儀(德國布魯克公司)，細菌藥敏MH培養基、細菌分離培養基由鄭州安圖生物科技有限公司提供，抗菌藥物紙片為英國Oxoid公司產品。陽離子調節的MH肉湯、LB肉湯瓊脂購自美國Becton Dickinson公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司；PCR擴增引物由 Invitrogen公司合成；凝膠成像儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.3細菌鑒定及藥敏分析 采用microflex LRF MALDI-TOF型質譜微生物鑒定儀對細菌進行菌種鑒定復核，質譜鑒定分值>2.0可以鑒定到種水平，分值在1.7～2.0可以鑒定到屬水平；采用微量肉湯稀釋法檢測美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、頭孢他啶、環丙沙星、米諾環素、氨曲南、頭孢吡肟、左氧氟沙星、替加環素、多黏菌素B、頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的最低抑菌濃度(MIC)，采用瓊脂稀釋法檢測磷霉素的MIC。多黏菌素和磷霉素的折點參照歐洲臨床微生物和感染病學會藥敏委員會(EUCAST)推薦的標準[5]。替加環素的折點參考美國食品和藥物管理局(FDA)推薦的標準，其他藥物折點參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI，2020)執行標準[6]，頭孢哌酮/舒巴坦的折點采用頭孢哌酮的折點。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.4碳青霉烯酶和mcr-1基因檢測 所有的CRE菌株采用加熱煮沸法提取細菌DNA，采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增幾種常見的碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaOXA-48、blaIMP和blaVIM)[7-8]。引物由Invitrogen公司合成。PCR反應體系體積25.0 μL，包括DNA模板3.0 μL，相應上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.1 μL。94 ℃預變性120 s，94 ℃變性30 s，退火延伸30 s，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR檢測多黏菌素耐藥基因mcr-1[9]。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外凝膠成像與分析系統觀察結果，PCR擴增產物送北京擎科新業生物技術有限公司進行測序，測序采用雙向通道；并將測序結果進行BLAST序列比對(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/;http：//www.bldb.eu/Enzymes.php) 。

1.5同源性分析 采用多位點序列分型(MLST)對碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)進行同源性分析。擴增肺炎克雷伯菌的7個管家基因：rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB 和tonB，PCR反應體系同1.4，所得 PCR 產物送北京擎科新業生物技術有限公司進行測序，測序結果于網站數據庫進行比對(http：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html)，獲取CRKP序列型別(ST型)。

1.6統計學處理 采用Excel 2007軟件進行數據處理，計數資料以例數或百分率表示。

2 結 果

2.1CRE菌株鑒定與分布情況 2015年1月至2020年12月本院臨床共分離出腸桿菌目細菌5 908株，其中38株為CRE菌株，總檢出率為0.6%，肺炎克雷伯菌15株,大腸埃希菌13株,其他腸桿菌目細菌10株。38株CRE經質譜儀鑒定，分值均>2.0。CRE主要分離自普內科、普外科、呼吸內科與危重癥醫學科，標本來源主要為痰液、血液、尿液等標本。見表1。

表1 CRE科室來源和標本來源分布情況

2.2藥敏結果 大多數CRE菌株對頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性較高。CRE菌株對多黏菌素B和替加環素敏感率分別為78.95%和89.48%。對阿米卡星、磷霉素和米諾環素敏感率分別為60.53%、55.26%和44.74%，其次是氨曲南(39.47%)、頭孢他啶/阿維巴坦(28.95%)、環丙沙星(15.79%)和左氧氟沙星(15.79%)。見表2。產blaKPC-2、blaKPC-3的CRE對頭孢他啶/阿維巴坦100%耐藥。然而，所有產金屬酶的CRE對頭孢他啶/阿維巴坦都有耐藥性(MIC>64 mg/L)。

2.3碳青霉烯酶和mcr-1基因檢測結果 38株CRE中,有35株碳青霉烯酶基因陽性和2株mcr-1基因陽性，1株未產酶。碳青霉烯酶基因包括23株blaNDM(65.71%,23/35)、8株blaKPC(22.86%,8/35)、3株blaIMP(8.57%,3/35)、1株blaVIM(2.86%,1/35)，未檢測到blaOXA-48基因陽性的菌株。CRKP中blaKPC-2檢出率最高(40.00%，6/15)，CRE中均為blaNDM-5(100.00%，13/13)。35株產碳青霉烯酶CRE的分布見表3。

2.4同源性分析結果 15株CRKP菌株MLST分型結果為ST11型7株(46.67%)、ST540型1株(6.67%)，ST1800型1株(6.67%)，ST2026型1株(6.67%)，ST22型1株(6.67%)，ST2666型1株(6.67%)，ST356型1株(6.67%)，ST394型1株(6.67%)，ST567型1株(6.67%)。

表2 38株CRE的藥敏試驗結果[n(%)]

表3 35株產碳青霉烯酶CRE的分布

3 討 論

隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床治療中的廣泛使用，CRE急劇增加。國內多中心研究顯示，臨床上的CRE主要是肺炎克雷伯菌，其次是大腸埃希菌和陰溝腸桿菌[10-11]。與CRE感染相關的醫療風險因素包括住院時間長、存在侵入性操作、使用過抗菌藥物、存在血液透析及長期護理設施暴露、入住重癥監護病房(ICU)等，還有研究發現服用左氧氟沙星和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑可能增加CRE感染風險[12]。

碳青霉烯類抗菌藥物治療臨床上大多數的革蘭陰性菌有效。然而，CRE不僅對相關碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，而且還對許多其他抗菌藥物耐藥，因此，CRE可導致難以治療的嚴重感染。此外，臨床上分離的CRE菌株包括大腸埃希菌、克雷伯菌腸桿菌屬、沙雷菌屬、變形桿菌屬等，這些細菌是各種感染性疾病的常見致病菌。與此同時，碳青霉烯類抗菌藥物耐藥基因通常在質粒上，從醫院感染和公共衛生的角度來看，更需特別關注。

CRE包括產生碳青霉烯酶的CRE(CP-CRE)和不產生碳青霉烯酶的CRE(非CP-CRE)。CP-CRE比非CP-CRE具有更高的MIC和更高的病死率。此外，碳青霉烯酶的編碼基因通常存在于可移動的遺傳元件上，因此CP-CRE的感染控制風險可能高于非CP-CRE[13]。本院的CP-CRE占比達到92.11%(35/38)，需引起重視。

在中國，KPC-2、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶在CRE臨床分離株中占優勢，碳青霉烯酶基因最多見的是肺炎克雷伯菌分離株中的blaKPC-2，以及兒童大腸埃希菌分離株中的blaNDM[14]。本院尚未發現有兒童檢出CRE，且目前本院產碳青霉烯酶CRE以blaNDM為主，達到65.71%，這可能與本院檢出的CRE菌株數量較少有關，也與細菌的地域分布差異有關。本院藥敏分析結果顯示，所有產金屬酶的CRE對頭孢他啶/阿維巴坦都耐藥，大多數產金屬β-內酰胺酶的CRE，尤其是那些產NDM型酶的CRE對β-內酰胺類和大多數非β-內酰胺類抗菌藥物(氨基糖苷類、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、四環素、氟喹諾酮類)高度耐藥，盡管阿維巴坦對金屬酶缺乏活性，但它與氨曲南在少數體外和動物研究中顯示出協同效應[15]，且這種聯合應用需要在臨床實踐中進一步評估。最近開發的氨曲南/阿維巴坦(ATM-AVI)組合用藥方案提供了一種新的治療選擇[16]，然而，相關研究揭示了多種產生NDM-5的大腸埃希菌分離株具有不同的克隆背景，表現出對ATM-AVI的MIC升高，并已在全球傳播(瑞士、巴基斯坦、印度、科威特、泰國、土耳其、哥倫比亞、委內瑞拉和美國)[17]，主要原因是產NDM-5大腸埃希菌的質粒都攜帶有blaCMY β-內酰胺酶基因，其中blaCMY-42等位基因占優勢[18]。

本研究結果顯示，在15株CRKP中，主要以blaKPC為主，占53.33%(8/15)，與國內研究基本一致[14]。而丹麥檢出的在CRKP中主要以blaOXA-48為主[19]。本研究結果顯示15株CRKP菌株MLST分型主要以ST11型為主(46.67%)，ST11型高致病性肺炎克雷伯菌菌株對人類健康構成重大威脅，因為它們同時具有高致病性、多藥耐藥性和高度傳染性。因此，應采取控制措施，防止CRKP在醫院環境和社區中進一步傳播[20]。

本研究結果顯示，大多數CRE菌株對常用抗菌藥物表現出高度耐藥性，潛在有用的藥物是替加環素、多黏菌素B、阿米卡星和磷霉素。本院在2015—2020年共檢出5株對多黏菌素B耐藥的CRE菌株，其中2株產mcr-1基因，有研究顯示目前我國產mcr-1的肺炎克雷伯菌為0.11%[21]，美國首次在耐多藥大腸埃希菌中發現了質粒介導的多黏菌素耐藥性，這引起了對泛耐藥細菌的擔憂[22]。多黏菌素(黏菌素和多黏菌素B)被認為是治療CRE感染的最后選擇。盡管沒有多黏菌素暴露，但臨床CRE分離株仍存在多黏菌素耐藥性。藥敏試驗結果顯示，我國多黏菌素的耐藥率為3.8%[23]。隨著新的β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑的引入，患者有了更多的選擇方案，避免使用多黏菌素而引起相關的不良反應[24]。對于一種或多種抗菌藥物仍具有活性的CRE菌株，大多數菌株使用聯合治療能取得良好的效果，經常使用的方案包括碳青霉烯類、多黏菌素、氨基糖苷類或替加環素等抗菌藥物的組合[25]。

臨床微生物實驗室的工作人員在預防CRE傳播和協助患者治療方面發揮著重要作用，實驗室人員應能夠提供準確的藥敏試驗結果，應提供CRE的相關酶型檢測結果，必要時應該加做個體化聯合藥敏試驗，同時結合各地區各醫院的數據，合理使用抗菌藥物。總之，本院的CRE總體分離率不高，本院尚未發現有兒童CRE菌株，且目前本院成人的CRE以blaNDM為主，未發現有CRE克隆菌株暴發流行，但本研究樣本量較小，后期需要再進一步分析。