miR-135a和miR-135b表達水平在子宮內膜癌預后評估中的價值

王秋梅，全培青，劉曉慶，孫姍姍，江燁伶

復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海 200011

子宮內膜癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，其發病率呈逐年升高的趨勢，嚴重威脅患者的健康和生命。子宮內膜癌早期一般沒有明顯癥狀，確診時往往已經為中晚期，出現淋巴結轉移和宮頸浸潤等情況，預后較差，因此，尋找早期診斷和預后判斷的指標具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是非編碼RNA核苷酸片段，與癌基因和抑癌基因的表達密切相關，對基因表達的調控，如癌細胞分化、增殖和凋亡具有重要作用，已經成為診斷癌癥及預后判斷的重要指標，尤其在預后判斷方面得到了學者們的關注[1]。DONKERS等[2]的研究發現，子宮內膜癌與良性子宮內膜疾病患者血清miR-135a和miR-135b的表達存在明顯差異，但是miR-135a和miR-135b是否能夠成為子宮內膜癌的預后判斷指標仍不清楚。本研究擬通過檢測子宮內膜癌患者血清中的miR-135a和miR-135b表達水平，觀察二者在子宮內膜癌預后判斷中的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年12月在本院接受子宮內膜癌手術的115例子宮內膜癌患者納入子宮內膜癌組，年齡45～79歲，平均(62.83±12.63)歲；體質量指數(BMI)為(23.53±2.18)kg/m2；病理類型：子宮內膜樣腺癌84例，黏液/漿液性腺癌31例；分化程度：中高分化70例，低分化45例；臨床分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期56例，Ⅲ期23例和Ⅳ期15例。納入標準：均符合子宮內膜癌的診斷標準，并經術后病理檢查證實；首次手術切除；臨床病歷資料完整；術前未經過放化療、內分泌和免疫治療等。排除標準：合并其他部位惡性腫瘤；合并其他婦科疾病；合并免疫性疾病；存在智力下降或者精神性疾病。選擇同期在本院體檢健康的45例女性納入對照組，年齡45～79歲，平均(62.19±11.62)歲;BMI為(23.19±2.07)kg/m2。兩組研究對象年齡、BMI比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1標本采集 抽取所有研究對象入院或體檢時肘靜脈血5 mL于抗凝管中，以3 000 r/min離心10 min，將上清液放置于—70 ℃的冰箱中保存待測。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 使用 mirVana miRNA 提取試劑盒提取標本中的總RNA，并使用 MagMAXTMmirVanaTMTotal RNA 分離試劑盒 (Thermo Fisher Scientific) 從血清中提取 RNA。根據說明書，使用 All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR 檢測系統(GeneCopoeia,Rockville,MD,USA)進行反轉錄PCR和qRT-PCR，以確定 miR-135a 和miR-135b的表達水平。基于 miR-135b 的退火溫度，采用 3 步法進行 qRT-PCR 檢測 miRNA 表達。初始變性設定為 95 ℃，持續10 min，1個循環。變性步驟設置為95 ℃ 10 s，退火步驟設置為55 ℃ 20 s，延伸步驟設置為72 ℃ 15 s，共40個循環。 U6作為內部對照，miRNA的相對表達水平采用2—ΔΔCt法計算。引物序列：U6正向引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；miR-135a正向引物為5′-AACCCTGCTCGCAGTATTTGAG-3′，反向引物為5′-GCGGCAGTATGGCTTTTTATTCC-3′；miR-135b正向引物為5′-GGGGTACCTCCTCTTCTTCACAATTTCTCTCAGTG-3′，反向引物為5′-GAAGATCTCAGTCACCTTTGAGGTCTGAG-CT-3′。

1.2.3隨訪 患者出院后，每兩個月到醫院門診隨訪1次，對于不能到醫院就診的患者，有專人進行電話隨訪，并記錄患者死亡、腫瘤復發和轉移情況。復發、轉移參照《子宮內膜癌診斷與治療指南(2021年版)》[3]中的診斷標準。根據B超、CT和MRI進行盆腔腫塊的檢查，必要時進行腫塊活組織檢查。隨訪兩年，出現死亡、腫瘤復發和轉移判斷為預后不良，無上述情況判斷為預后良好。

1.2.4觀察指標 比較子宮內膜癌組和對照組血清miR-135a和miR-135b表達水平；比較子宮內膜癌患者治療前后血清miR-135a和miR-135b表達水平；比較不同臨床特征和不同預后情況子宮內膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達水平；分析血清miR-135a和miR-135b表達水平預測兩年內子宮內膜癌患者出現預后不良的價值。分析子宮內膜癌患者血清miR-135a與miR-135b表達水平的相關性。

2 結 果

2.1兩組血清miR-135a和miR-135b表達水平比較 入院時，子宮內膜癌組血清miR-135a表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=10.734，P<0.001)；子宮內膜癌組術后7 d血清miR-135a表達水平較入院時明顯升高，差異有統計學意義(t=13.930，P<0.001)。 入院時，子宮內膜癌組血清miR-135b表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(t=18.601，P<0.001)；子宮內膜癌組術后7 d血清miR-135b表達水平較入院時明顯降低，差異有統計學意義(t=13.475，P<0.001)。見表1。

表1 兩組血清miR-135a和miR-135b表達水平比較

2.2不同特征子宮內膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達水平比較 低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移子宮內膜癌患者的血清miR-135a表達水平明顯低于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移子宮內膜癌患者，差異有統計學意義(P<0.05)；而低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者血清miR-135b表達水平明顯高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的子宮內膜癌患者，差異有統計學意義(P<0.05)。不同年齡、病理類型、腫瘤最大徑和肌層浸潤情況子宮內膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3不同預后情況子宮內膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達水平比較 隨訪2年，出現死亡6例，復發11例和轉移9例，為預后不良，其余89例患者為預后良好。預后不良子宮內膜癌患者血清miR-135a表達水平明顯低于預后良好子宮內膜癌患者，而預后不良子宮內膜癌患者血清miR-135b表達水平明顯高于預后良好子宮內膜癌患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4血清miR-135a和miR-135b表達水平對子宮內膜癌預后不良的預測效能 血清miR-135a和miR-135b表達水平預測子宮內膜癌患者發生預后不良的曲線下面積(AUC)分別為0.830、0.856，二者AUC差異無統計學意義(P>0.05)。根據子宮內膜癌患者是否發生預后不良將兩指標進行Logistic回歸分析，得到方程Y=—1.87XmiR-135a+1.99XmiR-135b—2.42作為聯合檢測指標，聯合檢測預測預后不良的靈敏度為92.3%，特異度為83.1%，AUC為0.932，聯合檢測預測子宮內膜癌患者發生預后不良的AUC明顯大于miR-135a和miR-135b單獨檢測(Z=2.391、2.247，P<0.05)。見圖1和表4。

表2 不同特征子宮內膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達水平比較

續表2 不同特征子宮內膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達水平比較

表3 不同預后情況子宮內膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達水平比較

圖1 血清miR-135a和miR-135b表達水平預測子宮內膜癌預后不良的ROC曲線

2.5子宮內膜癌患者血清miR-135a與miR-135b表達水平的相關分析 子宮內膜癌患者血清miR-135a表達水平與miR-135b表達水平呈負相關(r=—0.721，P<0.01)。

表4 血清miR-135a和miR-135b表達水平對子宮內膜癌預后不良的預測效能

3 討 論

子宮內膜癌以手術切除為主要治療方式，但手術效果并不理想。因此，尋找對病程和預后具有監測作用的靶標尤其重要。miRNA是一種非編碼RNA，具有高度的保守性，對基因具有明顯的調控作用，參與了細胞增殖、代謝、分化和凋亡等病理、生理調控過程，并與腫瘤的發生、發展具有密切關系。近年來研究顯示，血清中存在多種miRNA，并且性質極為穩定，對酸堿等環境耐受性較好，不易被內源性或者外源性的核苷酸酶降解，并且具有嚴格的組織特異性和時序特異性[4]。但在病理狀態下，miRNA會出現異常表達，并且在腫瘤的診斷和預后評估中越來越受到重視。在子宮內膜癌的研究中，同樣發現大量異常表達的miRNA參與了子宮內膜癌的發生、發展，對其診斷和預后的判斷具有重要的意義。

miR-135家族包括miR-135a和miR-135b兩個成員，在各種癌癥中出現異常表達。 miRNA可以作為癌基因或腫瘤抑制因子，多項研究表明miR-135a在癌癥進展中起著重要作用，既有促進癌細胞增殖，也有抑制癌細胞增殖的報道[5-6]。miR-135a還可以通過上皮間質轉化影響患者的預后。本研究結果顯示，子宮內膜癌患者血清miR-135a表達水平明顯低于對照者，并且發現子宮內膜癌患者術后血清miR-135a表達水平明顯升高，說明miR-135a可能與子宮內膜癌的發病具有一定的聯系。本研究結果顯示低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者血清miR-135a表達水平明顯低于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的患者(P<0.05)，說明miR-135a 在預測預后方面也具有潛在的應用價值。進一步研究顯示，預后不良子宮內膜癌患者血清miR-135a表達水平明顯低于預后良好子宮內膜癌患者(P<0.05)，說明血清miR-135a表達水平降低可能導致了子宮內膜癌患者的不良預后。有關miR-135a表達水平在卵巢癌中表達情況的研究發現，血清miR-135a高表達的卵巢癌患者預后良好，而miR-135a低表達與卵巢癌患者的較低的生存率和無進展生存期縮短有關[7-8]。對非小細胞肺癌的研究發現，血清miR-135a表達水平與遠處轉移、淋巴結轉移、TNM分期、病理分期關系密切，miR-135a低表達的患者生存期明顯短于miR-135a高表達的患者，miR-135a表達水平降低是非小細胞肺癌預后不良的獨立危險因素[9]。對經典霍奇金淋巴瘤的研究發現，miR-135a低表達的患者復發率更高，無病生存期更短[10]。對肝細胞癌的研究發現，miR-135a的高表達與肝癌切除后12個月內復發的高風險相關[11]。另一項研究發現，胃癌腫瘤組織中miR-135a的高表達與較短的生存期和較短的復發時間有關[12]。本研究結果顯示，血清miR-135a表達水平為2.73時，其預測子宮內膜癌預后不良的靈敏度為88.5%，特異度為75.3%，AUC為0.830，說明血清miR-135a表達水平在預測子宮內膜癌患者兩年內復發、轉移和死亡方面具有較高的價值。

miR-135b位于1號染色體上，定位在1q32.1，在腫瘤的發生、發展中具有重要作用，但在不同腫瘤組織中，其功能不盡相同。如在前列腺癌和膠質母細胞瘤中，miR-135b可作為腫瘤抑制因子[13-14]。然而，在乳腺癌、肝細胞癌和結直腸癌等癌癥中，miR-135b是一種腫瘤促進因子，可促進癌細胞增殖和遷移[15-17]。本研究結果顯示，入院時，子宮內膜癌組血清miR-135b表達水平明顯高于對照組，并且發現子宮內膜癌組術后7 d血清miR-135b表達水平較術前明顯降低，說明miR-135b在子宮內膜癌中作為促癌基因存在，與文獻[18]報道的結果一致。本研究結果還顯示，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者血清miR-135b表達水平明顯高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移患者，并且預后不良患者血清miR-135b表達水平明顯高于預后良好患者，說明血清miR-135b表達水平與子宮內膜癌的預后關系密切。一項關于脂肪肉瘤的研究發現，miR-135b高表達與預后不良相關[19]。另一項研究表明miR-135b-5p過表達是胰腺導管腺癌預后不良的獨立預測因子，具有促進腫瘤細胞增殖和遷移的作用，與腫瘤預后不良有關[20]。本研究結果顯示，血清miR-135b表達水平為3.21時，其預測子宮內膜癌患者術后預后不良的靈敏度為73.1%，特異度為84.3%，AUC為0.856，具有較高的預測效能。同時本研究顯示血清miR-135a與miR-135b聯合檢測對子宮內膜癌患者預后不良的AUC明顯大于miR-135a和miR-135b單獨檢測，說明兩項指標具有互補性。另外，相關性分析結果顯示，子宮內膜癌患者血清miR-135a與miR-135b表達水平呈負相關，進一步說明了二者在子宮內膜癌中具有一定的聯系，miR-135a有抑癌作用，而miR-135b有促癌作用，二者處于某種平衡，其具體機制需要進一步研究。

綜上所述，miR-135a和miR-135b可能參與了子宮內膜癌的發生及發展過程，是子宮內膜癌預后的潛在預測指標。