彌漫大B細胞淋巴瘤CD68和CD34表達情況及臨床價值

王雪蓮，孫麗華

復旦大學附屬中山醫院青浦分院血液科，上海 201700

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤，是一組在遺傳學、病理特征、免疫表型和臨床表現及治療反應上均具有高度異質性的侵襲性血液腫瘤[1]。DLBCL的影響因素包括遺傳分子生物學、生活方式、家族史、藥物、免疫紊亂和職業等，DLBCL還具有不同的組織學特征，易在疾病早期發生遠處擴散。利妥昔單抗與環磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松的聯合使用(R-CHOP方案)是目前治療DLBCL的標準治療方案。盡管使用了R-CHOP方案進行治療，仍有許多DLBCL患者出現早期復發，甚至死亡[2]。近年來，隨著醫療技術的不斷發展，腫瘤微環境(TME)在DLBCL中的作用機制及其對預后判斷的價值已成為最新的研究熱點。TME是基于腫瘤細胞與基質成分、細胞外基質、炎癥細胞和免疫細胞之間的相互作用，并在這個相互作用中表現出組成空間特征的顯著異質性[3]。腫瘤相關巨噬細胞(TAM) 作為TME的重要組成部分，在腫瘤發生、發展中發揮著重要作用，其中CD68是TAM的特征性標志物之一。有研究發現，套細胞淋巴瘤中CD68陽性巨噬細胞計數升高與預后不良有關[4]。CD34是常用的血管內皮標志物，TAMMA等[5]通過對濾泡性淋巴瘤的研究發現，CD34陽性的微血管不僅數量較多，而且CD34陽性的微血管數量與CD68陽性和CD163陽性巨噬細胞計數呈正相關，提示該類型巨噬細胞亞群具有重要血管生成潛力，微血管密度(MVD)升高者預后較差。所以，尋找有效的生物標志物來判斷DLBCL的預后就顯得非常重要。本研究應用免疫組化(SP)法檢測DLBCL中CD68和CD34的表達，并分析二者判斷DLBCL預后的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2016年5月至2019年5月本院診斷為DLBCL的67例患者資料。納入標準：(1)符合2008年世界衛生組織(WHO)制訂的淋巴造血組織腫瘤分類標準；(2)經病理檢查確診，且為初次診斷；(3)確診后正常治療；(4)患者的生存期大于3個月以上。排除標準：(1)合并代謝性疾病及嚴重心、肝、肺、腎功能障礙的患者；(2)有自身免疫性疾病病史的患者；(3)既往有惡性腫瘤病史患者；(4)由惰性淋巴瘤進展為DLBCL的患者。所有患者均簽署知情同意書，本研究已通過本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法 采用SP法檢測CD68和CD34在DLBCL中的表達情況。手術切除腫瘤組織，石蠟切塊、脫蠟、水化、烤片，浸于二甲苯5 min，并采用100%、95%、90%、85%和75%乙醇梯度處理，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，阻斷內源性過氧化物酶，再進行抗原修復，分別滴加稀釋CD68單克隆抗體和鼠抗人CD34 單克隆抗體一抗，4 ℃條件下過夜，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，加辣根酶標記鏈霉卵白素，PBS沖洗，增敏二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染5 min，充分水洗，分化，返藍，乙醇梯度，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.3結果判斷 CD68陽性判斷標準：隨機選取5個高倍視野，與背景著色相對比，對染色強度進行評分，無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。對陽性細胞所占的百分比進行評分，陰性記0分，陽性細胞<10%記1分，陽性細胞為10%～<30%記2分，陽性細胞為30%～<50%記3分，陽性細胞為50%～<75%記4分，陽性細胞≥75%記5分。最后得分為染色強度與陽性細胞百分比分數之和，0～1分為CD68陰性表達，2～8分為CD68陽性表達。CD34標記的MVD判定：采用MVD計數方法，在低倍鏡下選擇3個密度最高的微血管區域，計算CD34所染成棕色的微血管數量，所得平均值則為MVD。

1.4隨訪 隨訪時間從疾病確診開始，截止時間為2022年5月31日，隨訪內容包括患者的一般情況、治療和近期復查情況，方式為查閱電子版和紙質版病歷。另以電話的形式隨訪患者的3年總生存率(OS)和無進展生存率(PFS)，OS的計算是從DLBCL的確診到腫瘤本身引起的死亡，或隨訪滿3年終止；PFS的計算是從DLBCL的確診到腫瘤復發、轉移或病情惡化。

1.5統計學處理 采用 SPSS20.0統計軟件進行數據處理及統計分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，組間生存期的比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CD68和CD34的總體表達情況 67例DLBCL患者中，40例CD68表達為陽性，陽性率為59.7%，染色的細胞膜有棕黃色顆粒，并呈現多角形、擴張狀和閉塞的條索狀等不規則狀態；35例CD34表達為陽性，陽性率為52.2%，細胞膜或者細胞質呈棕褐色或者棕黃色，形態清晰。見圖1。

注：A為CD68陽性表達；B為CD68陰性表達；C為 CD34陽性表達；D為CD34陰性表達。

2.2不同特征DLBCL患者的CD68和CD34表達情況比較 不同年齡、性別、原發部位、B癥狀出現情況[淋巴瘤患者出現以下任意一項癥狀者：原因不明的發熱(通常38 ℃以上)、盜汗、原因不明的體質量減輕10%以上]、血清乳酸脫氫酶(LDH)水平的DLBCL患者CD68及CD34陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、國際預后指數(IPI)評分為3～4分、有骨髓侵犯DLBCL患者的CD68及CD34陽性率明顯高于Ann Arbor臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI評分為0～2分、無骨髓侵犯DLBCL患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34表達情況比較[(n)%]

2.3不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表達情況比較 不同年齡、性別、原發部位、B癥狀出現情況、血清LDH水平DLBCL患者的CD68和CD34共同表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～4分、有骨髓侵犯的DLBCL患者CD68和CD34共同表達率明顯高于Ann Arbor臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI評分為0～2分、無骨髓侵犯DLBCL患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4CD68和CD34表達對DLBCL患者生存預后的影響 67例DLBCL患者中，共有4例患者失訪，失訪率為6.0%。CD68陽性患者的3年OS和PFS分別為52.5%和45.0%，CD68陰性患者的3年OS和PFS分別為77.7%和70.4%，CD68陽性患者的3年OS和PFS均低于CD68陰性患者，差異有統計學意義(P=0.047、0.044)；CD34陽性患者的3年OS和PFS分別為51.4%和42.9%，而CD34陰性患者的3年OS和PFS為75.0%和68.8%，CD34陽性患者的3年OS和PFS也低于CD34陰性患者，差異有統計學意義(P=0.030、0.013)。見圖2～5。

表2 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表達情況比較[(n)%]

續表2 不同特征DLBCL患者的CD68和CD34共同表達情況比較[(n)%]

圖2 CD68陽性與陰性患者的3年OS生存曲線比較

圖3 CD68陽性與陰性患者的3年PFS生存曲線比較

圖4 CD34陽性與陰性患者的3年OS生存曲線比較

圖5 CD34陽性與陰性患者的3年PFS生存曲線比較

3 討 論

DLBCL占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，臨床上常表現為單個或多個、淋巴結內或淋巴結外快速增長的腫塊。目前DLBCL的發病率呈逐年上升趨勢，即使患者使用包括R-CHOP方案在內的多種不同方案進行治療，患者5年生存情況也不理想，因此，尋找新的治療方法迫在眉睫[2]。另外，由于DLBCL在免疫表型、細胞形態和臨床特征等方面均具有明顯的異質性，所以不同的亞型、不同的個體間在治療效果、臨床特點和預后方面存在明顯差異。目前，針對免疫檢查點、TME、分子信號通路和表觀遺傳畸變的療法，以及細胞免疫療法共同構成了DLBCL治療的新格局[6]。所以，準確和有效地識別危險度不同的患者就顯得非常重要，特別是對于高危患者，早期診斷有助于采取積極有效的治療措施，對改善患者的預后具有重要的意義。目前，隨著分子生物學技術及免疫治療技術的發展，TME中的某些相關因子在DLBCL中的表達及其臨床意義逐漸受到重視。在TME中，TAM不僅能夠促進TME中的炎癥反應，還可以產生細胞外基質調節因子和促血管生長因子，刺激腫瘤的生長[7]。 CD68是巨噬細胞通用型標志物，有研究表明CD68的表達可以評估TME中TAM水平，在某些DLBCL中CD68的高表達提示預后不良[8]。LI等[9]通過對DLBCL的研究發現，CD68高表達患者的OS和PSF均低于CD68低表達患者,此外，還可以通過檢測CD68的表達進一步識別高危患者，尤其是那些被IPI歸類為低/中危的患者。

同時，血管為腫瘤生長提供營養和氧氣支持，為臟器轉移提供特殊通道，腫瘤血管密度越高則越利于癌細胞生長，腫瘤的侵襲性越強。而CD34作為公認的血管內皮標志物，存在于內皮依賴性血管的細胞上，CD34表達與血管生成有關，在腫瘤新生血管的內皮細胞中高表達，在正常組織的血管內皮細胞中不表達或者低表達。采用CD34抗體進行SP染色觀察腫瘤MVD，可以有效反映腫瘤的血管生成。血管內皮生長因子(VEGF)能夠促進血管內皮細胞的生長，誘導TME中微血管的生成，促進DLBCL的發生及進展。TAMMA等[10]在另一項針對黏膜相關淋巴瘤的研究中發現，MVD和M2型巨噬細胞呈正相關，該結論可為開發新的免疫治療策略提供積極幫助。

本研究采用67例DLBCL患者作為研究對象，研究結果顯示：40例CD68表達為陽性，陽性率為59.7%，35例CD34表達為陽性，陽性率為52.2%，CD68和CD34的陽性率均達到50.0%以上；同時比較了不同特征患者CD68、CD34的表達情況，結果發現，Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI評分為3～4分、有骨髓侵犯DLBCL患者的CD68及CD34陽性率明顯高于Ann Arbor臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI評分為0～2分、無骨髓侵犯DLBCL患者(P<0.05)。本研究進一步分析了CD68和CD34表達對DLBCL患者生存預后的影響，結果顯示，CD68陽性和CD34陽性患者的3年OS和PFS分別低于CD68陰性和CD34陰性患者，提示TAM與DLBCL的預后有關。TAM的成分及成分之間的相互作用與患者的預后密切相關，TAM能夠更好地區分預后較差的患者，并為下一步治療提供一個新的方向[3]。

綜上所述，CD68和CD34陽性表達與DLBCL患者的Ann Arbor臨床分期、IPI 評分、骨髓侵犯及生存預后具有一定的關系，且CD68和CD34陽性DLBCL患者預后不良。