癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達水平及其臨床意義

趙錦華，楊霖崧，吳亞欣，賈麗娟，李文強，惠宇航

咸陽市第一人民醫院神經內科，陜西咸陽 712000

癲癇是由各種原因導致的大腦神經元異常放電，是一種臨時性、突發性腦功能紊亂的臨床綜合征，嚴重影響患者的生活質量和生命安全[1-2]。癲癇發病機制復雜，目前病因尚未完全明確，探討與癲癇發作相關的基因或蛋白的表達有積極意義。CD69在急性病變，如腦血管損傷、心肌梗死、大手術等嚴重創傷中會導致外周血淋巴細胞亞群活性發生改變，即外周血T細胞的CD69表達上調[3]。研究顯示，CD69與缺血性腦卒中后的腦損傷有關[4]。微小核糖核酸(miRNA)是一類內源性非編碼RNA，多種miRNA參與神經元壞死、異常通路形成及神經膠質細胞增生等病理過程，從而調節皮質發育及腦功能，在癲癇的發生及調控中起重要作用[5-6]。有研究顯示，精神分裂癥患者miR-130b表達上調，且在治療后其表達降低[7]。但關于CD69、miR-130b-3p在癲癇方面的研究相對較少，因此，本研究通過檢測癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達水平，探討二者與癲癇發生、發展的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年2月至2019年2月本院神經內科收治的95例癲癇患者作為癲癇組。(1)納入標準：①符合《臨床診療指南：癲癇病分冊》[8]癲癇診斷標準，均采用一線抗癲癇藥物單藥或多藥聯合治療患者；②根據患者家族史、腦電圖、體格檢查等確診患者。(2)排除標準：①既往有腦外傷史、手術史患者；②伴有神經及其他系統疾病患者；③合并聽力、視力障礙及失語等患者；④近期服用過抗焦慮、抗抑郁藥物或其他影響認知功能藥物的患者。95例患者中男55例，女40例；年齡28～47歲；癲癇的發作類型：局灶性發作34例，全面性發作24例，全面性發作合并局灶性發作30例，不明類型7例。根據病情嚴重程度將癲癇患者分為輕度(2個月發作1次或更少)31例，中度(1個月發作<4次，但2個月發作>1次)22例，重度(1個月發作≥4次)42例。另選取同期來本院進行健康體檢的健康者60例作為對照組，其中男33例，女27例；年齡27～48歲。癲癇組與對照組的性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。所有研究對象均自愿加入本研究，并簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會審核通過。

表1 兩組一般資料比較[n(%)或

組別n病程<1年1～<3年3～<6年≥6年居住地城市農村對照組60----35(58.33)25(41.67)癲癇組9529(30.53)19(20.00)25(26.32)22(23.16)53(55.79)42(44.21)χ2/t-0.097P-0.755

1.2儀器與試劑 庫爾特Epics XL型流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自濟南千司生物技術有限公司。TRIzol試劑購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒(貨號J6547M)、qRT-PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；miR-130b-3p、U6引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集癲癇患者在發作后24 h及對照者健康體檢時的空腹外周靜脈血4 mL，分為2份，1份置于抗凝管中，用于檢測外周血CD69表達水平；另1份室溫放置2 h自然凝固，4 ℃及12 000 r/min條件下，離心15 min，取上層血清分裝至無菌離心管，標記后-80 ℃冰箱凍存，用于檢測miR-130b-3p表達水平。

1.3.2流式細胞儀檢測外周血CD69表達水平 在對照管和檢測管中加入100 μL乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)抗凝全血，同時加入20 μL法國產熒光標記單抗IgG2a-PE及P-gp-PE，使其混合均勻，進行15 min的避光染色，采用同型IgG作為陰性對照，在Q-Prep標本制備儀上自動溶血、固定，調整好流式細胞儀光路后檢測標本。計數104以上個細胞。

1.3.3qRT-PCR檢測外周血miR-130b-3p表達水平 采用TRIzol試劑提取所有研究對象外周血中的總RNA，并以反轉錄試劑盒中的方法將其反轉錄為cDNA，進行qRT-PCR，每份標本重復3次。反應條件：94 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s；70 ℃ 10 s；39個循環。以U6作為內參基因，反應結束后確認qRT-PCR的擴增曲線和溶解曲線，采用2-ΔΔCt法計算miR-130b-3p的相對表達量。引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

2 結 果

2.1兩組外周血CD69、miR-130b-3p表達水平比較 與對照組比較，癲癇組外周血CD69、miR-130b-3p表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血CD69、miR-130b-3p表達水平比較

2.2不同嚴重程度癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達水平比較 與輕度患者比較，中度、重度患者外周血CD69、miR-130b-3p表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與中度患者比較，重度患者外周血CD69、miR-130b-3p表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.3癲癇患者外周血CD69與miR-130b-3p表達水平的相關性 Pearson相關分析結果顯示，癲癇患者外周血CD69與miR-130b-3p表達水平呈正相關(r=0.546，P<0.05)。

表4 不同嚴重程度癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達水平比較

2.4Logistic回歸分析癲癇發生的影響因素 將是否發生癲癇作為因變量(是=1，否=0)，排除年齡等混雜因素后，以外周血CD69、miR-130b-3p表達水平作為自變量，進行Logistic回歸分析，結果顯示，外周血CD69、miR-130b-3p表達水平升高是癲癇發生的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析癲癇發生的影響因素

3 討 論

癲癇是臨床上比較常見的中樞神經系統疾病，臨床表現以反復性、短暫性、發作性的中樞神經系統功能紊亂最為突出。相關研究顯示，世界總人口中5‰～7‰的人群受癲癇疾病的折磨，部分癲癇患者需要使用抗癲癇藥物進行長期治療以控制病情，抗癲癇藥物的使用可對患者神經系統和胃功能造成一定影響，從而影響癲癇患者的生活質量，且近年來癲癇的發病率呈現明顯的上升趨勢[9-11]。

CD69是T細胞活化后最早表達的抗原，當其表達后可作為輔助刺激分子，使細胞進一步活化和增殖，屬于自然殺傷(NK)細胞信號傳遞復合體基因家族的一員，在活化的NK細胞及T細胞表面均可表達，在未活化的NK細胞及T細胞上均不表達，故CD69可作為一種活化誘導分子來反映細胞的活化狀態。此外，CD69也是NK細胞殺傷活化性受體之一，其可以傳遞活化信號，反映NK細胞的殺傷功能和活化狀態，在NK細胞沒有殺傷功能時，CD69表達缺失[12]。楊立利等[13]研究結果表明，急性脊髓損傷患者CD69水平明顯高于健康對照者，表明外周血淋巴細胞對急性脊髓損傷的刺激產生了積極的免疫應答。本研究結果表明，癲癇組外周血CD69表達水平高于對照組(P<0.05)；與輕度患者比較，中度和重度患者外周血CD69表達水平升高，與中度患者比較，重度患者外周血CD69表達水平升高，提示CD69水平升高可能與癲癇的嚴重程度有關。此外，Logistic回歸分析結果表明，外周血CD69表達水平升高是癲癇發生的危險因素，進一步提示CD69可能在癲癇病情進展中發揮一定作用。

miRNA參與調節免疫反應、神經元可塑性，且miRNA轉錄后處理參與了神經系統的生理學過程及信號通路的基因表達調控[14]。目前研究認為，血清miRNA主要從患者組織細胞中主動分泌進入血液循環，血清miRNA表達水平可反映病變組織內的情況[15]。HU等[16]研究發現，大鼠癲癇模型中大腦組織與外周血中的miRNA-34a、miRNA-22、miRNA-125a、miRNA-21表達水平均升高。本研究發現，癲癇組外周血miR-130b-3p表達水平高于對照組(P<0.05)，且隨著癲癇患者病情嚴重程度加重，外周血miR-130b-3p表達水平不斷升高，提示miR-130b-3p表達水平上調可能參與癲癇的發生及疾病進展。本研究中Logistic回歸分析發現，外周血miR-130b-3p表達水平升高是癲癇發生的危險因素，提示檢測miR-130b-3p表達水平可能對評估癲癇發生有積極意義。此外，Pearson相關分析結果顯示，癲癇患者外周血CD69與miR-130b-3p表達水平呈正相關(P<0.05)，提示CD69、miR-130b-3p表達可能共同參與疾病發展，檢測二者表達水平對于評估癲癇患者病情具有一定的參考價值。

綜上所述，癲癇患者外周血中CD69、miR-130b-3p呈高表達，檢測CD69、miR-130b-3p表達水平可能對評估癲癇患者病情嚴重程度有幫助。