白藜蘆醇對鼻咽癌轉移能力的影響及其分子機制

吳華杰 ，屠德楨 ，李 磊 ，喬 涵 ，李國萍

（1）云南省腫瘤醫院頭頸外二科，云南 昆明 650118;2）福建省福州市兒童醫院耳鼻咽喉科，福建 福州 350005）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）來源于鼻咽部粘膜上皮，是我國南方高發腫瘤之一，因其位置隱匿，難以早期發現，故多數患者就診時已處于III、IV 期。鼻咽癌的治療以放射治療為主，聯合化療和/或分子靶向治療，經綜合治療，仍有30%～40%的患者出現復發或遠處轉移，一旦出現復發和轉移，其5 a 生存率僅有25%到35%[1]，化療耐藥和放療抵抗是治療失敗的主要原因之一。對放、化療后復發和轉移的患者，再次行放、化療效果較差，靶向治療和免疫治療價格昂貴、副作用較大、緩解時間較短。中藥白藜蘆醇（Resveratrol）在自然界中分布廣泛、易于提取，它可以抑制包括鼻咽癌在內的多種腫瘤的增殖、促進腫瘤細胞凋亡，并可增加鼻咽癌對放射治療和化學治療的敏感性；可抑制口腔癌、乳腺癌、大腸癌、肺癌等多種腫瘤的轉移[2?6]，白藜蘆醇是否能抑制鼻咽癌的轉移，其可能的機制是什么，目前尚未見研究報導。本研究擬觀察白藜蘆醇對鼻咽癌轉移能力的影響并初步探討其影響鼻咽癌轉移的分子機制，為鼻咽癌的治療提供一種安全有效的治療辦法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鼻咽癌細胞株CNE2 來源于云南省腫瘤醫院腫瘤研究所。Transwell 遷移和侵襲小室購自美國Corning 有限公司。BCA 法蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。ECL 化學發光檢測試劑購自Millipore 公司。CCK8 試劑盒購自日本 DOJINDO 公司。MMP2、MMP9、p-Hsp27（ser82）抗體購自Cell Signaling technology，Inc。GAPDH、E-cadherin、Vimentin、Hsp27、Ezrin、p-Ezrin（T567）、Keratin18（角蛋白18）抗體均購自Abcam 公司。白藜蘆醇、二甲基亞砜（DMSO）、抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）購自美國Sigma 公司。

1.2 細胞增殖抑制（CCK-8）實驗

取對數生長期鼻咽癌CNE2 細胞，用胰酶消化為細胞懸液，接種于96 孔板對應的孔內，每孔加入3000 個細胞，然后將96 孔板在培養箱中培養過夜。在96 孔板中加入不同濃度的白藜蘆醇，在培養箱內分別孵育24 h、36 h 及48 h，每組設置5 個副孔；用移液器吸去培養板中廢液，然后加入100 μL 無血清培養基到對應孔中，再向每孔加入10 μL CCK-8 反應液；加完反應液后，將培養板放回培養箱內繼續孵育2 h，使用酶標儀測定其在450 nm 處的吸光度（OD 值）。計算細胞增殖率：[（給藥組OD 值-對照組OD 值）/對照組OD 值]%。

1.3 Transwell 小室試驗

遷移實驗：取對數生長期鼻咽癌CNE2 細胞，用胰酶消化為細胞懸液，用細胞計數板將密度調整為5×105個/mL。向對應的孔中加入500 μL 含15%FBS 的 1640，細胞懸液 200 μL 加入到Transwell 遷移小室，然后將小室輕輕放入含15%FBS 的1640 培養基的對應孔中，放回孵箱，常規培養24 h；24 h 后，棄去小室內液體，用棉簽擦去小室內面的細胞，用PBS 漂洗3 次，置于4%多聚甲醛中固定20 min；再置于0.1%結晶紫中染色20 min；隨后取下小室的底膜，將其貼在載玻片上，蓋上蓋玻片；每張膜隨機取5 個視野（×200），在顯微鏡下計數小室下室面的細胞數。侵襲實驗：選用鋪膠的侵襲小室，其余步驟同遷移實驗。

1.4 免疫熒光實驗

制備鼻咽癌CNE2 細胞爬片，各細胞組經白藜蘆醇處理后，按免疫熒光化學試驗步驟處理，在濕盒中避光室溫孵育2 h，用含抗熒光淬滅劑和DAPI 的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，觀察NF-κB/p65 的核轉位情況。

1.5 WB 實驗

用不同濃度（0、10、20、40、80 μmol/L）的白藜蘆醇處理鼻咽癌細胞CNE2，24 h 后用RIPA 裂解液提取蛋白，用BCA 法定量蛋白濃度。取25 μg 蛋白上樣，經過SDS-PAGE 凝膠電泳，轉移至PVDF 膜上，用5%的脫脂牛奶封閉液封閉2 h，加入一抗（1∶1000），在4 ℃下孵育過夜。TBST 漂洗3 次后，加入二抗（1∶2000）孵育1 h，TBST 再次清洗后，使用AI600 圖像分析系統，拍照采集圖像，采集圖像后用Image Pro Plus 軟件計算各條帶的灰度值，并計算目的基因與管家基因的比值，進行定量分析統計。

1.6 動物實驗

選擇SPF 級 BALB/C 雌性裸鼠（4～5 周左右，體重約18～22 g），嚴格飼養于SPF 動物房層流架SPF 環境中，恒溫、恒濕、隔音、空氣層流過濾，分籠飼養，每籠5 只，滅菌水和飼料均由動物自由飲食用。動物飼養盒、空氣過濾器、墊料、飼料和飲水等均經高壓蒸汽滅菌，并定期更換。

裸鼠經適應性喂養1 周后，取對數生長期鼻咽癌CNE2 細胞，胰酶消化成細胞懸液，用細胞計數板計數后離心，每次均為1000 r/min，5 min，用PBS 緩沖液洗滌3 次，用 PBS 緩沖液配制成2×105個細胞/只/30 μL 的細胞懸液，置于冰盒中，1 h 內按無菌操作要求用微量注射器注射入裸鼠左側后肢的足掌皮下，每只裸鼠接種30 μL 細胞懸液。將20 只裸鼠根據白藜蘆醇的給藥濃度隨機分為4 組，即為0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg 和100 mg/kg 組，每組5 只裸鼠。種瘤后第2 天開始，治療組每天給予不同濃度的白藜蘆醇-羧甲基纖維素混懸液灌胃，給藥量為小鼠體重（g）×20 μL/g，對照組根據小鼠體重給予相應體積的溶劑（0.5%羧甲基纖維素）。每天觀察裸鼠活動、飲食等情況，每隔3 d 測量裸鼠體重。自注射部位出現肉眼可見的腫瘤組織，開始記錄最大長徑（L）和橫徑（W），估算腫瘤體積（V），V=L×W2/2。至仁慈終點，將裸鼠麻醉，頸椎脫臼法處死，取材。取雙側腘窩淋巴結和足掌部腫瘤組織，拍照，測量大小和重量，置于4%多聚甲醛中固定，送至病理科石蠟包埋、切片后進行HE 染色和免疫組化染色，顯微鏡下觀察癌組織和Keratin18 染色情況。

1.7 統計學處理

實驗所得數據均采用SPSS22.0 軟件進行統計分析，實驗至少重復3 次。計量資料數據用均數±標準差表示，多個樣本的均數比較用單因素方差分析，2 組間的比較用t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇可抑制鼻咽癌CNE2 細胞的增殖能力

CCK8 實驗發現，白藜蘆醇對鼻咽癌CNE2 細胞的增殖有抑制作用，且抑制作用呈濃度和時間依賴性。當白藜蘆醇濃度為80 μmol/L 以下，作用于CNE2 細胞24 h，白藜蘆醇對CNE2 細胞的抑制率未超過50%，圖1。考慮到抑制率超過50%時存活細胞數量較少，可能影響到后續遷移和侵襲實驗的結果，故選擇0、10、20、40、80 μmol/L 5 個不同濃度白藜蘆醇處理CNE2 細胞24 h 以進行后續實驗。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對鼻咽癌CNE2 細胞增殖的抑制作用Fig.1 The effect of different concentrations of Resveratrol on the proliferation of CNE2 cells

2.2 白藜蘆醇明顯抑制鼻咽癌CNE2 細胞的侵襲、遷移能力

Transwell 遷移侵襲實驗發現，用10、20、40、80 μmol/L 白藜蘆醇處理CNE2 細胞24 h 后，各濃度組的穿膜細胞明顯少于對照組（0 μmol/L 組）見圖2，隨著白藜蘆醇濃度的增高，對鼻咽癌CNE2 細胞遷移和侵襲能力的抑制作用增強。

圖2 Transwell 實驗檢測白藜蘆醇對鼻咽癌細胞CNE2 侵襲和遷移能力的影響（結晶紫染色，×400）Fig.2 Effect of Resveratrol treatment on migration and invasion of CNE2 cell by transwell assay（crystal violet staining，×400）

2.3 白藜蘆醇可抑制鼻咽癌CNE2 細胞中NFκB/p65 的核轉位

CNE2 細胞經過免疫熒光染色，紅色代表NFκB/p65，細胞核顯示為藍色。實驗結果顯示，白藜蘆醇可能抑制NF-κB/p65 的核轉位，抑制作用呈濃度依賴性，見圖3。

圖3 免疫熒光實驗檢測NF-κB/p65 在鼻咽癌CNE2 細胞中的定位（×400）Fig.3 Immunofluorescence experiments showed the location of NF-κB/p65 in CNE2 cells（×400）

2.4 白藜蘆醇可降低轉移相關蛋白表達水平

Western blot 檢測發現，不同濃度（0、10、20、40、80 μmol/L）白藜蘆醇處理鼻咽癌CNE2 細胞24 h 后：細胞內上皮表型標志物E-cadherin 的表達水平上升（圖4A）；細胞內MMP2 和MMP9 的表達水平下調（圖4B）；細胞內磷酸化Ezrin（p-Ezrin）的表達水平明顯下調（圖4C）；細胞內磷酸化Hsp27（p-Hsp27）的表達水平明顯下調（圖4D）。

圖4 Western blot 檢測白藜蘆醇對轉移相關蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of Resveratrol on expression of metastasis related proteins by western blot

2.5 白藜蘆醇可抑制體內鼻咽癌的轉移能力

裸鼠淋巴結檢測發現，見圖5，足掌皮下成瘤后，瘤側腘窩淋巴結與空白對照組相比明顯腫大。給予白藜蘆醇灌胃治療后，隨白藜蘆醇濃度增高，淋巴結腫大程度明顯減輕。實驗結果證明，白藜蘆醇灌胃能明顯減輕瘤側腘窩淋巴結的腫大程度。

HE 染色發現（圖6A）：空白對照組（正常淋巴結）細胞排列規則，形態正常；足掌皮下成瘤后，未給予白藜蘆醇治療組，同側淋巴結內出現多個轉移灶（箭頭所示，下同），淋巴結正常組織結構破壞，腫瘤細胞排列紊亂，聚集成堆，細胞邊界不清或呈一群不規則裸核；給予白藜蘆醇治療組，隨濃度由低到高，轉移灶減少，淋巴結結構漸趨正常。

免疫組化發現（圖6B）：空白對照組（正常淋巴結）未見Keratin18 陽性細胞；足掌皮下成瘤后，未給予白藜蘆醇治療組，同側淋巴結內出現大量Keratin18 陽性細胞（棕褐色，代表轉移的腫瘤細胞）；給予白藜蘆醇治療組，隨著濃度由低到高，Keratin18 陽性細胞逐漸減少。組織學檢測顯示，白藜蘆醇灌胃明顯抑制了鼻咽癌細胞由足掌皮下成瘤部位向腘窩淋巴結的轉移，且抑制作用呈劑量依賴性。

圖6 白藜蘆醇灌胃明顯抑制了鼻咽癌細胞由足底向腘窩淋巴結的轉移Fig.6 Resveratrol gavage significantly inhibited the metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells from the subcutaneous tumor formation site to the popliteal lymph nodes

2.6 白藜蘆醇灌胃治療對荷瘤小鼠體重無明顯影響

體重測量發現，在裸鼠足掌皮下注射鼻咽癌CNE2 細胞后，每日經灌胃給予裸鼠不同劑量（0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）的白藜蘆醇，每3 d 測量一次體重，各組裸鼠體重未見明顯差異，見圖7。

圖7 白藜蘆醇灌胃治療對荷瘤小鼠體重的影響Fig.7 Effect of Resveratrol gavage treatment on the body weight of tumor-bearing nude mice tumor-bearing nude mice

3 討論

中藥白藜蘆醇為天然多酚類化合物，廣泛分布于虎杖、葡萄、花生等 70 余種植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等多種生物學效應。白藜蘆醇可通過抑制 TGF-β、Wnt/β-Catenin、PI3K/Akt/NF-κB、Akt/GSK-3β/Snail 等信號通路增加上皮表型標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和β-連環素（β-catenin）的表達、減少間質表型標志物N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和纖維連接蛋白（Fibronectin）的表達、抑制上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），進而抑制口腔癌、乳腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤的侵襲和轉移[2?5]。白藜蘆醇能否抑制鼻咽癌的轉移能力，目前國內外研究報導較少。本研究Transwell 實驗發現：白藜蘆醇能抑制鼻咽癌CNE2 細胞的遷移、侵襲能力，在0至80 μmol/L 濃度范圍內，隨著白藜蘆醇濃度的增高，對鼻咽癌CNE2 細胞遷移、侵襲能力的抑制作用逐漸增強。動物實驗進一步證實了白藜蘆醇能明顯抑制鼻咽癌細胞由裸鼠足掌皮下成瘤部位向腘窩淋巴結的轉移，其抑制作用呈濃度依賴性。

鼻咽癌的轉移涉及到多種分子機制及信號通路，國內外研究發現，熱休克蛋白27（hsp27）、埃茲蛋白（Ezrin）、核轉錄因子κB（NF-κB）、基質金屬蛋白酶（MMPs）、上皮間質轉化（EMT）等因子與鼻咽癌的轉移密切相關[6?10]。白藜蘆醇能否通過調節上述因子影響鼻咽癌的侵襲和遷移能力，目前國內外尚未見研究報導。

HSP27 是熱休克蛋白家族的主要成員之一，其重要的生物學功能是保護細胞免受各種應激因素的損傷，并參與調節細胞的增殖、分化及凋亡。磷酸化HSP27（p-HSP27）是HSP27 的活性形式，其高表達與多種腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、頭頸鱗癌等的發生、發展、侵襲有關。HSP27 是NF-κB 的上游調節分子之一，研究發現：HSP27 的過度表達可激活PI3K/AKT/NF-κB信號通路、誘導EMT，進而促進唾液腺樣囊性癌、肺癌、肝癌等腫瘤的侵襲和遷移[11?14]；此外，抑制Hsp27 的表達可導致MMPs 的活性明顯下降，表明Hsp27 對MMPs 活性具有一定抑制作用[15]。本研究顯示：白藜蘆醇處理鼻咽癌CNE2 細胞對總HSP27 的表達無明顯影響，但對磷酸化Hsp27的表達有明顯抑制作用，表明白藜蘆醇可通過抑制Hsp27 的磷酸化進而抑制鼻咽癌的侵襲和轉移能力。

埃茲蛋白（Ezrin）為連接于細胞膜和細胞骨架之間的埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白（Ezrin-radixinmoesin，ERM）家族成員之一，主要表達于各種類型的上皮細胞，具有調節細胞形態、粘附和活性，穩定細胞間連接，參與信號轉導等功能。研究發現，磷酸化的Ezrin（p-Ezrin）可通過活化NF-κB信號通路促進結直腸癌的轉移，其可能是NFκB 的上游調節因子；Ezrin 也可通過調節Ecadherin、整合素促進鼻咽癌轉移，還可通過降解NGX6a、TMEM8B-a 增加鼻咽癌的侵襲和轉移能力[16,17,18]。本研究中，白藜蘆醇處理鼻咽癌CNE2 細胞對Ezrin 總量無明顯影響，但能抑制Ezrin 的磷酸化水平，提示白藜蘆醇可以通過抑制Ezrin 的活化進而抑制鼻咽癌的轉移能力。

核轉錄因子κB（NF-κB）是一種作用十分廣泛的真核細胞轉錄因子，正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白I?B 結合，以無活性的復合物形式存在于胞漿中。在某些細胞外信號（如細菌，病毒等）或致瘤因素的刺激下，I?B 激酶（IKK）活化，引起I?B-ɑ的絲氨酸殘基磷酸化，隨后泛素化降解，釋放出NF-κB，NF-κB 由細胞質轉入細胞核，與特定的DNA 系列結合，啟動相關基因的轉錄，參與調控細胞的增生、分化和凋亡。I?B-ɑ是hsp27 的靶蛋白之一，hsp27 可促進I?B-ɑ的泛素化和后續降解，從而增強NF-?B 的活性。研究發現：NF-?B 的異常活化和表達與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[19]，NF-κB 信號通路的激活是MMP2、MMP9 表達所必須的；多種因子可通過NF-κB 信號通路促進EMT、增加MMP 的表達水平，進而促進鼻咽癌的轉移能力[7?8,20?21]；白藜蘆醇可通過抑制NF-κB 的轉錄活性抑制MMP 的表達、進而抑制惡性膠質瘤、肺癌等腫瘤的轉移[22?23]。本研究中，免疫熒光實驗初步證實，白藜蘆醇可能抑制CNE2 細胞中NF-κB/p65 的核轉位，從而降低NF-κB 的轉錄活性，抑制NFκB 下游轉移相關靶基因的表達，與其他學者所發現的白藜蘆醇對腫瘤細胞中NF-κB 的抑制效應一致，后續課題組將進一步通過EMSA 實驗觀察白藜蘆醇對NF-κB 核轉位的抑制作用。

EMT 是指某些生理和病理狀態下出現的上皮細胞向間質細胞轉化的現象，表現為上皮表型標志物 E-cadherin 和β-catenin 的表達減少，間質表型標志物N-cadherin、Vimentin 和Fibronectin的表達增加，是上皮源性惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟之一。MMPs 是一個大的蛋白質家族，其能通過降解細胞外基質破壞腫瘤細胞侵襲轉移的組織學屏障，在腫瘤的侵襲和轉移中起關鍵作用，是腫瘤侵襲轉移過程中的主要蛋白水解酶，目前研究較多的是MMP-2、MMP-9。研究發現EMT 及MMP 在鼻咽癌的轉移中發揮重要作用[9,21,24?25]。本研究發現：不同濃度白藜蘆醇處理鼻咽癌CNE2 細胞24 h 后，上皮標志物Ecadherin 的表達水平上升，但間質標志物Vimentin 水平無明顯變化，提示白藜蘆醇可通過上調E-cadherin 抑制CNE2 細胞的上皮間質轉化，從而降低CNE2 細胞的變形遷移能力；對于Vimentin 水平無明顯變化的原因尚需進一步研究。本研究用Western blot 實驗檢測了MMPs 蛋白的表達水平，結果顯示，白藜蘆醇對MMP2 和MMP9 均有較明顯的抑制作用，由此可見，白藜蘆醇能通過抑制MMP2 和MMP9 的表達進而抑制鼻咽癌的侵襲遷移能力。

綜上所述，本研究證實白藜蘆醇在體外和體內均能有效抑制鼻咽癌CNE2 細胞的遷移、侵襲和轉移，其分子機制可能與腫瘤轉移相關蛋白Ezrin 和Hsp27 的磷酸化水平下調、NF-κB/p65核轉位抑制、EMT 相關蛋白E-cadherin 表達上調、基質金屬蛋白酶家族MMP2 和MMP9 下調密切相關。白藜蘆醇可能通過抑制Ezrin、Hsp27 的磷酸化，進而抑制NF-κB/p65 的核轉位，從而下調MMP2、MMP9 的表達水平、上調E-cadherin 的水平進而抑制EMT，最終抑制鼻咽癌的轉移能力。