不同劑量天麻素對(duì)甲基苯丙胺依賴CPP 大鼠海馬中TLR4/MyD88/NF-κB 炎癥信號(hào)通路的影響

朱婷娜 ，曹媛媛 ，張 園 ，劉鵬亮 ，王一航 ，吳亞梅 ，李利華 ，趙永娜 ，洪仕君

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2）法醫(yī)學(xué)院;3）國(guó)際教育學(xué)院，云南 昆明 650500;4）云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650106）

甲基苯丙胺（Methamphetamine，Meth）具有強(qiáng)效的成癮性，在全世界范圍內(nèi)濫用，嚴(yán)重?fù)p害社會(huì)秩序和身體健康[1]。反復(fù)攝入Meth 會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成眾多負(fù)面影響，長(zhǎng)期濫用Meth 會(huì)激活膠質(zhì)細(xì)胞，使炎癥介質(zhì)和毒性分子過度積累誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，同時(shí)改變大腦的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致大腦的認(rèn)知功能發(fā)生障礙[2]。海馬對(duì)藥物成癮的調(diào)節(jié)受到廣泛關(guān)注，海馬體在調(diào)節(jié)藥物相關(guān)行為的聯(lián)想記憶中起重要作用，而這些行為可能會(huì)在藥物再次暴露時(shí)引起復(fù)發(fā)[3]。已有眾多研究發(fā)現(xiàn)Meth 濫用會(huì)導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生。神經(jīng)炎癥會(huì)改變神經(jīng)元的興奮性、可塑性，引發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙，血腦屏障通透性受損和神經(jīng)變性等一系列的過程，最終可能導(dǎo)致抑郁、精神障礙和認(rèn)知障礙等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生[4?5]。Toll 樣4 受體（Toll like receptor 4，TLR4）作為一個(gè)跨膜識(shí)別受體，主要是通過MyD88 途徑在免疫和炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（Tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）和磷酸化的NFκB 抑制因子（Inhibitor of NF-κB，IκB）是TLR4的下游蛋白，是炎癥反應(yīng)的進(jìn)程和NF-κB 轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要調(diào)控因子[7?8]。NF-κB 的活性程度與機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生和眾多生理功能的形成密切相關(guān)，其中p65 是NF-κB 的主要活性亞單位[9]。TLR4/MyD88/NF-κB 通路可能參與Meth 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的發(fā)生，該通路是探索炎癥發(fā)生機(jī)制和選擇藥物治療靶點(diǎn)的研究熱點(diǎn)之一。

天麻素（Gastrodin，Gas）是從傳統(tǒng)中藥材天麻的根莖中經(jīng)化學(xué)方法獲得的生物活性化合物，具備安眠、抗炎、抗驚厥、改善學(xué)習(xí)與記憶的藥理作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，天麻素在治療焦慮、抑郁、腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要作用。基于上述背景，天麻素的抗炎作用是否通過TLR4/MyD88/NF-κB 這條經(jīng)典的炎性通路發(fā)揮作用具有較大的研究?jī)r(jià)值。本研究擬采用不同劑量的天麻素干預(yù)CPP 大鼠，探索天麻素是否通過對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 通路關(guān)鍵因子的調(diào)控，而發(fā)揮對(duì)Meth 依賴CPP 大鼠海馬的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD 大鼠 60 只，雄性，體重（190±10）g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[許可證號(hào)：SCXK（滇）K2015-002]。實(shí)驗(yàn)大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)開始前，先將大鼠放于CPP 箱內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要藥品和試劑

實(shí)驗(yàn)使用的Meth 由云南省公安廳公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合法提供，經(jīng)過萃取、分離純化。干燥后將其制成鹽酸鹽結(jié)晶體保存，純度在98%以上。實(shí)驗(yàn)使用的天麻素純度98.0%，由昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心陸地教授提供，為白色粉狀物，室溫干燥后保存。TLR4 抗體（sc-293072、美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司）；MyD88 抗體（ab2064，美國(guó)Abcam 公司）；NF-κB p65 抗體（8142s、德國(guó)CST 公司）；p-NF-κB p65 抗體（sc-136548、美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司）；IκB-α 抗體（9242、德國(guó)CST 公司）；p-IκBα 抗體（2859、德國(guó)CST 公司）；TRAF6 抗體（66494、美國(guó)Proteintech 公司）；β-actin 抗體（ab6276，美國(guó)Abcam 公司）；HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（L3012、美國(guó)SAB 公司）；HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗（A21010、美國(guó)Abbkine 公司）；熒光定量試劑盒（DBI-2043、德國(guó)DBI 公司）；BestarTMqPCR RT Kit（DBI-2220、德國(guó)DBI 公司）；引物合成由擎科生物科技有限公司合成。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

大鼠 CPP 實(shí)驗(yàn)箱（XR-XT401，上海欣軟信息有限公司）；酶標(biāo)儀（Touch 2，美國(guó)BioTek 公司）；普通PCR 儀、熒光定量 PCR 儀（T100TMThermal Cycler、C1000 TouchTMThermal Cycler，美國(guó)Bio-Rad 公司）；垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（552BR、221BR，美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.4 動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以隨機(jī)的形式被分為6 組，每組10 只。這6 組包括對(duì)照組、Meth 組、天麻素組、Meth+低中高劑量天麻素干預(yù)組（10、30、100 mg/kg）。對(duì)照組和Meth 組分別給予10 mg/kg生理鹽水和10 mg/kg Meth；天麻素組給予100 mg/kg 天麻素。給藥方式皆使用腹腔注射（intraperitonealinjection，IP），1 次/d，連續(xù)不間斷給藥14 d。根據(jù)給藥方法，Meth 依賴CPP 大鼠模建立成功[10]。Meth+低中高劑量天麻素干預(yù)組（10、30、100 mg/kg），前14 d 和Meth 組操作相同；在Meth 依賴模型建立成功后，根據(jù)組別分別予以對(duì)應(yīng)劑量的天麻素（10、30、100 mg/kg）干預(yù)，每天1 次，持續(xù)14 d。

1.5 CPP 實(shí)驗(yàn)

CPP 實(shí)驗(yàn)適應(yīng)階段（d1～3），打開2 個(gè)箱體之間的隔板，讓大鼠自由探索，每次30 min，每日1 次。在d4，讓大鼠在CPP 箱內(nèi)訓(xùn)練15 min，測(cè)定每只大鼠15 min 內(nèi)在兩箱的停留時(shí)間，評(píng)判大鼠的天然偏愛性，將大鼠停留時(shí)間短的箱體指定為伴藥箱。CPP 訓(xùn)練階段（Day5-Day18），封閉2箱體連接通道，連續(xù)14 d 對(duì)大鼠采用腹腔注射后，立刻放入伴藥箱進(jìn)行適應(yīng)30 min。d19，將隔板打開，使大鼠在CPP 箱體內(nèi)自由探索15 min，測(cè)定大鼠在伴藥箱的停留時(shí)間。天麻素干預(yù)階段（d20-35），確保大鼠產(chǎn)生CPP 效應(yīng)后，再采用低中高劑量的天麻素（10、30、100 mg/kg）連續(xù)不間斷干預(yù)14 d，干預(yù)結(jié)束后再將大鼠放入箱體內(nèi)進(jìn)行CPP 測(cè)試，用時(shí)15 min。

1.6 實(shí)驗(yàn)大鼠海馬組織取材

CPP 測(cè)試結(jié)束后，經(jīng)乙醚吸入麻醉所有大鼠，暴露其胸腔和腹腔，灌注生理鹽水至肝臟發(fā)白，斷頭取出全腦，參照《大鼠立體定位圖譜》（第2 版），暴露海馬組織并分離，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western Blot 實(shí)驗(yàn)

將海馬組織清洗剪碎，加入適量RIPA 組織裂解液，將組織超聲破碎后室溫放置30 min，每10 min 上下振搖1 次。離心15 min 后進(jìn)行蛋白定量分析。進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育（抗體配制比例除β-actin 為1∶10000，TLR4、MyD88、TRAF6、IκB -α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α 配制比例均為1∶1000），置于4℃孵育過夜。洗膜后孵育二抗（室溫/2 h），再次洗膜，利用ECL 顯影。以β-actin 作為標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照。Image J 軟件計(jì)算條帶的平均灰度值（OD 值）。

1.8 熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)

海馬組織中加入適量Trizol 裂解液，獲取組織內(nèi)總RNA，使用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA 濃度，一般測(cè)定兩次取平均值。之后按照說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后擴(kuò)增目標(biāo)基因，經(jīng)預(yù)變性（5 min/94 ℃），變性（10 s/ 94 ℃），退火（10 s/53 ℃），延伸（20 s/60 ℃）共展開40 個(gè)循環(huán)。完成后檢測(cè)得到擴(kuò)增曲線從而計(jì)算出Ct 值。目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量采取2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0、GraphPad Prism 5.0 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采取單因素方差分析及t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、圖2，與對(duì)照組比較，Meth 組TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達(dá)均升高（P<0.01、P<0.05 或P<0.001），p-NF-κB p65、p-IκB-α 的蛋白表達(dá)升高（P<0.01 或P<0.05），IκB-α 蛋白和mRNA 表達(dá)均降低（P<0.01）。與Meth 組相比，經(jīng)低中高不同劑量的天麻素（10、30、100 mg/kg）持續(xù)作用14 d 后，天麻素呈劑量相關(guān)性地升高了IκB-α 的蛋白和mRNA 表達(dá)（P<0.01 或P<0.05）。TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達(dá)（P<0.001、P<0.01 或P<0.05）與p-NF-κB p65 的蛋白表達(dá)（P<0.01 或P<0.05）均降低，且與天麻素給藥呈劑量相關(guān)性。p-IκB-α 的蛋白表達(dá)降低（P<0.01）。

圖1 不同劑量天麻素對(duì)甲基苯丙胺依賴CPP 大鼠海馬TLR4、MyD88、TRAF6、p-IκB-α、IκB-α、NF-κB p65、p-NFκB p65 蛋白表達(dá)的影響Fig.1 The effect of different doses of gastrodin on the expression of TLR4，MyD88，TRAF6，p-IκB-α，IκB-α，p-NF-κB p65，NF-κB p65 proteins in the hippocampus of methamphetamine-dependent rats

圖2 不同劑量天麻素對(duì)Meth 依賴大鼠海馬TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)的影響Fig.2 The effect of different doses of gastrodin on the mRNA expression of TLR4，MyD88，TRAF6，IκB-α，NF-κB p65 in the hippocampus of meth-dependent rats

3 討論

甲基苯丙胺作為一種高度成癮的精神興奮劑，是世界上濫用最廣泛的藥物之一。持續(xù)使用Meth會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變和認(rèn)知功能障礙，炎癥可能是Meth 導(dǎo)致神經(jīng)毒性的一個(gè)重要原因。大量研究表明，Meth 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞，影響海馬等大腦相關(guān)區(qū)域炎癥因子的變化，最終影響海馬的多種生理功能[3，11?13]。海馬是大腦中與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，在研究成癮物質(zhì)的復(fù)吸性和成癮記憶形成方面有著重要價(jià)值[14]。CPP 模型是研究情景關(guān)聯(lián)和獎(jiǎng)勵(lì)相關(guān)行為的經(jīng)典動(dòng)物模型[15?17]。本研究通過連續(xù)不間斷給予10 mg/kg Meth 14d（ip，qd）成功建立Meth 依賴CPP 大鼠模型。

TLR4 作為天然免疫識(shí)別受體，通過MyD88通路發(fā)揮作用。其過程為TLR4 與MyD88 橋接，其中涉及TRAF6 的激活，增強(qiáng)IκB 的磷酸化，從而導(dǎo)致NF-κB 級(jí)聯(lián)的活化[18，19]。TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)的過度活化可引起機(jī)體產(chǎn)生大量炎性物質(zhì)，從而誘發(fā)或加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在Meth大鼠毒性模型中，大鼠紋狀體中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)與TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB 等蛋白的高表達(dá)相關(guān)，大鼠海馬CA1 區(qū)也會(huì)因炎性因子表達(dá)增加而產(chǎn)生神經(jīng)炎癥[8,20]。Re G F 等[21]發(fā)現(xiàn)，在急性戒斷期間，Meth 會(huì)導(dǎo)致小鼠紋狀體和海馬釋放的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和促炎細(xì)胞因子增加，引起神經(jīng)炎癥。本研究采用Western Blot 和RT-qPCR同時(shí)檢測(cè)通路相關(guān)蛋白和mRNA 的表達(dá)情況，筆者發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，Meth 組的通路相關(guān)蛋白和mRNA 表達(dá)顯著增加，結(jié)果提示Meth 激活TLR4/MyD88/NF-κB 通路誘導(dǎo)Meth 依賴大鼠海馬產(chǎn)生神經(jīng)炎癥。天麻素是一種酚類糖苷，具有鎮(zhèn)靜、抗眩暈、抗焦慮、改善記憶、抗炎、抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化等藥理作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有潛力[22]。現(xiàn)有研究表明[23?25]，天麻素在炎癥調(diào)控方面效果顯著，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。劉英杰等的研究以毛果蕓香堿誘發(fā)癲癇大鼠為模型，發(fā)現(xiàn)天麻素會(huì)產(chǎn)生抗炎作用，主要表現(xiàn)在天麻素可降低大鼠海馬組織中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)[26]。Mei Z X 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)天麻素可降低先兆子癇引起的 MyD88 表達(dá)上調(diào)。文歡等[28]研究發(fā)現(xiàn)天麻素干預(yù)使NF-κB p65、p-NF-κB p65 等炎癥相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)下調(diào)，從而減輕皮層神經(jīng)細(xì)胞糖氧剝奪再?gòu)?fù)供的炎性損傷。Zheng X 等學(xué)者[29]研究發(fā)現(xiàn)天麻素通過影響TLR4/NF-κB/NLRP3 通路改善由脂多糖誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)炎癥。課題組前期的研究也證實(shí)天麻素在Meth 成癮和Meth 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷方面皆有積極意義[30?31]。因此，從炎癥方面著手對(duì)Meth 依賴進(jìn)行干預(yù)治療或許有很好的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，與Meth 組相比，經(jīng)低中高劑量的天麻素干預(yù)14 d 后，Meth 依賴CPP 大鼠海馬中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達(dá)，p-NF-κB p65 的蛋白表達(dá)皆隨天麻素劑量呈依賴性降低；IκB-α 的蛋白和 mRNA 表達(dá)皆隨天麻素劑量呈依賴性升高；p-IκB-α 的蛋白表達(dá)降低。結(jié)果提示天麻素可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 通路關(guān)鍵因子的表達(dá)，改善Meth 依賴導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥。本研究在Meth 依賴大鼠CPP 模型中通過蛋白和mRNA 水平首次提出天麻素可通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 通路關(guān)鍵因子的表達(dá)，緩解Meth 依賴導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥。

綜上所述，本研究重點(diǎn)闡述不同劑量的天麻素對(duì)Meth 依賴CPP 大鼠的干預(yù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，Meth 依賴誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與TLR4、MyD88、NFκB 等蛋白的高表達(dá)相關(guān)，天麻素可通過介導(dǎo)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)Meth誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步為天麻素對(duì)Meth 依賴所致的神經(jīng)炎癥的治療提供了新的思路。