miR-219-5p 靶向SOX5 在口腔癌中的作用初探

周 婷 ，何 影 ，董曉函 ，習楊彥彬 ，陳 波 ，佟 鈞 ，毛 瑞

（1）昆明醫科大學 口腔醫學院，云南 昆明 650500;2）武警云南省總隊醫院 門診部，云南 昆明 650100;3）昆明醫科大學 基礎醫學院，云南 昆明 650500;4）昆明醫科大學科技成果孵化中心，云南 昆明 650500;5）昆明醫科大學體育部，云南 昆明 650500）

頭頸部癌癥是人類第6 大常見癌癥，約占總癌癥種類的3%，這其中48%屬于口腔癌。全世界每年約有30 萬例新發口腔鱗狀細胞癌病例，中國口腔癌的發病率約為5～6 人/10 萬[1]。口腔癌具有進展快、浸潤廣、預后差的特點，盡管目前手術及放化療等治療技術在不斷提高，但是遠未達到理想效果，口腔癌的長期生存率仍然低于50%[1?2]。若能深入闡明其發病的分子機制，綜合多項分子靶點進行預測或治療，則有望在口腔癌的早期診斷、治療方面有所突破。

SOX5（SRY-related high-mobility-group box 5）屬于SOX 轉錄因子家族的成員。近年的研究發現，SOX5 在軟骨組織分化、性別決定中起到重要的作用，并可促進多種腫瘤的發展與轉移。而目前關于SOX5 在口腔癌中的表達情況以及其在口腔癌中的可能作用還不清楚。小分子RNA（miRNA）是一類長度為17～25 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們在轉錄后基因表達調控中起著重要的作用。越來越多的研究表明，miRNA 參與口腔癌的發生與發展過程，對口腔癌中miRNA 的表達變化以及其調控基因的研究，有助于推進我們對口腔癌發生發展分子機制的認識。最近的研究表明，miR-219-5p 做為新的癌癥相關miRNA，可抑制包括結直腸癌、胃癌、卵巢癌及膠質瘤癌等多種癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程，miR-219-5p 在這些癌組織中的表達下調。但目前關于miR-219-5p 在口腔癌中的表達和作用尚不清楚。

根據生物學軟件的預測，以及對SOX5 基因3’-UTR（非編碼區域）的分析，作者發現SOX5是miR-219-5p 的一個潛在靶基因，那么SOX5和miR-219-5p 是否參與到口腔癌的發生進展中呢？如果是，miR-219-5p 是否通過對SOX5 的靶調控參與了口腔癌的發生進展呢？為了解決以上問題，本研究擬對miR-219-5p/ SOX5 在口腔癌中的作用做一初探，擬為臨床治療提供全新的藥物治療靶點依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人舌鱗癌細胞株SCC4、SCC9 和人正常皮膚成纖維細胞（HF）購自中國科學院上海細胞庫。SCC4 和SCC9 細胞由中國科學院上海細胞庫進行STR 驗證。本研究中沒有使用錯誤識別和/或污染的細胞系。

miR-219-5p 模擬物、miR-219-5p 抑制劑、miRNA 模擬物陰性對照（miR-NC）和siRNA 陰性對照（miR-219-5p 抑制劑，NC）由中國廣州瑞博生物有限公司提供。用Lipofectamine 3000 試劑盒（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）進行細胞轉染實驗。

TRIzol?（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）及miRNeasy mini kit（Qiagen AB）用于總RNA 的提取，All-in-OneTM miRNA 定量RTPCR 檢測試劑盒（GeneCopoeia 公 司）用 于miR-219-5p 的RT-qPCR 分析。用于miRNAhsa-miR-219-5p 及U6（內參基因）RT-PCR 分析的引物購自Applied Biosystems 及 Thermo Fisher Scientific公 司。采 用 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase（Takara Bio，Inc.）及2×Mix SYBR Green I（Takara Bio，Inc.）檢測樣本中SOX5 mRNA 的表達水平。采用BCA 試劑盒（北京生物技術公司）檢測蛋白濃度。

1.2 細胞分組

細胞在制備好的培養基中經過第12 代傳代培養，該培養基成分為：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）/F12（DMEM）/F12（ThermoFisher，上海，中國）、2 mmol/L 谷氨酰胺、10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素 和100 mg/mL 鏈霉素（ThermoFisher 科學，上海，中國）。在提供5%CO2、恒溫37 ℃的培養箱中培養。

將1.5 μL miR-219-5p 模擬物（3 μmol/L）、5 μL miR-219-5p 抑制劑（2.5 μmol/L）或等量 的Lipofectamine 3000 試劑盒中的空白對照劑加入SCC4 和SCC9 細胞系進行瞬時轉染。所使用的miRNA 的序列描述如下：miR-219-5p 模擬物，UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU；miR-219-5p 模擬物空白對照（miR-NC），UGGAUUCCUUAACUUC CCAA；miR-219-5p 抑制劑，UUCAACCAGGAAA AG-UUGGGAAU；miR-219-5p 抑制劑空白對照（miR-219 inhibitor NC），AUGGCACGUGUACUCC UACAUAC。將濃度為1×106的各細胞系接種在培養皿中，按照制造商的說明書建議，在37 ℃下用上述試劑共培養48 h。隨后，收集處理過的細胞進行進一步的分析，包括逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）及Western blot 實驗等。

1.3 miR-219-5p 靶向SOX5 基因及其結合區域的驗證

根據miRMine（http://www.microrna.org）在線網站的計算，預測SOX5 mRNA 的3′-UTR 序列中miR-219-5p 的結合位點為5′-GGACCAAA-3′，據此，設計驗證實驗中相應突變位點序列為5′-GCAGGCCA-3′。

應用熒光素酶報告基因檢測驗證口腔癌細胞中miR-219-5p 靶向調控SOX5 基因。通過分子克隆實驗將野生型（wt）和突變型（mut）序列插入pmirGLO 載體（購自Promega 公司）。在熒光素酶活性測定實驗中，miR-219-5p 模擬物或抑制劑分別用wt-SOX5 和mut-SOX5 或對照報告質粒轉染口腔癌細胞。轉染48 h 后，使用雙熒光素酶報告分析系統（Promega，Madison，WI）測量螢火蟲（firefly）和海腎（Renilla）的熒光素酶活性，設定海腎熒光素酶活性作為內部對照。螢火蟲的熒光素酶活性以海腎Renilla 的熒光素酶活性為準做標準化處理。所有實驗均重復進行3 次。

1.4 RT-qPCR

按發表文獻的方法描述、運用RT-qPCR 檢測各細胞株中miR-219-5p 和SOX5 的相對表達水平[3]。參照樣本中U6 的表達水平對miR-219-5p 的相對表達量參照進行標準化[4]。引物設計并購自Invitrogen（Thermo Fisher Scientific，Inc.），所用引物序列描述如下，hsa-miR-219-5p：正向，5′-UAUCCACUUGAUCG-GCCUAC-3′；反向5′-GCUCCGCTGUAGACCUAUCUGCA-3′ ；GAPDH，正向5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，反向5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3′；SOX5，正向5′-CGTAACGAGCCTATGCAAT-3′，反向 5′ -TACC GGAAGCTA-CAATGCA-3′。每個PCR 反應由兩部分組成，包括95 ℃初始變性3 min，多次循環擴增（36 個循環，95 ℃ 10 s，56.5 ℃ 20 s，75 ℃30 s），隨后95 ℃變性15 s，65 ℃退火10 s，最終95 ℃延伸10 s GAPDH 作為內參基因。用2-ΔΔCq法評價各基因的相對表達水平[5]。

1.5 Western blot 分析

Western blot 檢測SOX5 蛋白在個樣本中的表達水平。按BCA 檢測試劑盒說明書檢測蛋白濃度。取蛋白質樣品（40 μg）用10% SDS-PAGE 分離，轉移到硝化纖維素膜上（中國碧云天生物）。用5%的脫脂牛奶封閉纖維素膜2 h，隨后，加入一抗SOX5（1∶1000；cat.no.sc- 293215；Santa Cruz 生物技術公司）和GAPDH（1∶500；cat.no.sc-47724；Santa Cruz 生物技術公司），4 ℃下孵育過夜。0.01 mol/L PBS 漂洗3 次，每次5 min；HRP 標記的二抗IgG（1∶2000；cat.no.sc-516102）在20～24 ℃孵育2 h。用增強的化學發光試劑（EMD，Millipore）觀察纖維膜上免疫印跡信號。以GAPDH 作為蛋白表達的參考。蛋白質的印跡結果采用Bio-Rad 化學發光凝膠成像系統（Bio-Rad，美國）顯影，印跡的條帶采用Image J 軟件（V1.8.0.172，美國）進行光密度值的分析。

1.6 統計學處理

運用SPSS 軟件（SPSS inc.，version21.0，美國）對數據進行統計分析。采用方差分析（ANOVA）和Student-Newman-Keuls 檢驗（Student-Newman-Keuls test）測定各組間mRNA 和蛋白表達水平是否具有顯著性差異。計量數據表述方式采用均數±標準差（standard deviation，SD），P<0.05 為差異有統計學意義。用Pearson 相關系數分析miR-219-5p 與SOX5 的表達水平是否具有相關性。

2 結果

2.1 在口腔癌細胞株中miR-219-5p 表達下調、SOX5 表達上調

RT-qPCR 及Western blot 的檢測結果顯示：在人口腔癌細胞株SCC4 及SCC9 中，miR-219-5p 的表達下調（圖1A），與正常細胞株HF 相比有統計學差異（P<0.05）；而SOX5 的基因（圖1B）及蛋白（圖1C）表達水平顯著增加，與正常細胞株HF 相比有統計學差異（P<0.05）；Pearson 相關系數分析合并后各組數據結果顯示，人口腔癌細胞株中miR-219-5p 及SOX5 的表達水平r=-0.869，絕對值接近1，說明miR-219-5p 的表達水平和SOX5 的表達水平呈現負性相關。

圖1 miR-219-5p 及SOX5 在人口腔癌細胞株SCC4 及SCC9 中的表達檢測Fig.1 The expressions of miR-219-5p and SOX5 in oral squamous cell lines SCC4 and SCC9

2.2 miR-219-5p 通過靶向3′-UTR 區域調控口腔癌細胞中SOX5 的表達

miR-219-5p 通過靶向3′-UTR 區域調控口腔癌細胞中SOX5 的表達見圖2。

由于SOX5 和miR-219-5p 在口腔癌細胞中表達趨勢相反，呈現負性相關，筆者推測miR-219-5p 可能通過特定的“種子”區域靶向調控SOX5 mRNA 表達。為了驗證這一推測，我們使用miRMine 來預測SOX5 mRNA 中miR-219-5p可能的結合位點。結果表明，SOX5 mRNA 的3′-UTR 上確實存在miR-219-5p 的結合位點，SOX5 是miR-219-5p 的潛在靶基因（圖2A，紅色標注的為miR-219-5p 與SOX5 mRNA 靶向結合的潛在位點）。根據此結合位點，筆者設計驗證實驗中相應突變位點序列為5′-GCAGGCCA-3′（圖2B，黃色標示的為突變后的序列）。

接下來的雙熒光素酶報告實驗揭示：與相應對照組（SOX5 3′UTR-wt+miR-NC）相比，未經突變處理的野生型SOX5 3′UTR-wt 與miR-219-5p 模擬物（SOX5 3′UTR-wt+miR-219-5p）聯合轉染可顯著降低SCC4 與SCC9 的熒光素酶活性（P<0.05，圖2C-D）。而在SOX5 種子序列區做了突變處理即SOX53′-UTR-mut 載體轉染后的細胞中，miR-219-5p 處理均不能誘導SCC4 或SCC9 細胞中熒光素酶活性降低（SOX5 3′UTR-mut+miR-NC vs.SOX5 3′UTR-mut+miR-219-5，P>0.05，圖2C-D）。

圖2 miR-219-5p 靶向3’-UTR 特異性序列調控SOX5Fig.2 miR-219-5p regulates SOX5 by binding to specific sites in 3’-UTR

為了進一步確定在口腔癌細胞中miR-219-5p 是否靶向調節SOX5 的表達水平，筆者用miR-219-5p 模擬物或抑制劑處理SCC4 和SCC9 細胞，隨后檢測SOX5 的表達水平。結果顯示，miR-219-5p 模擬物處理后顯著抑制了SOX5 表達，而miR-219-5p 抑制劑處理顯著恢復了SCC4（圖3A～B）和SCC9（圖3C～D）細胞中SOX5 的表達水平，與各自的對照組相比具有統計學差異（P<0.05）。這些結果驗證了在口腔癌細胞中miR-219-5p 通過與SOX5 mRNA3′-UTR 中特定的序列結合而靶向調控SOX5 的表達。

3 討論

作為SOX 轉錄因子家族的成員，SOX5 除了在軟骨組織分化、性別決定中起到重要的作用，也是許多疾病的易感基因，可促進鼻咽癌[6]、舌癌[3]、肝癌[7]、乳腺癌[8]和前列腺癌[9]等多種腫瘤的發展與轉移。Huang 等發現SOX5 通過調控SPARC 的表達下降來促進鼻咽癌的進展，同時SOX5 在鼻咽癌組織中的過表達與臨床低生存率成正相關性[6]；在肝癌及乳腺癌中，SOX5 通過Smad3-Sox5-Twist1 信號通路促進上皮-間質轉化及腫瘤細胞的入侵[7?8]；在前列腺癌中，SOX5 通過調控Twist1 的表達來調節TGF-β 誘導的上皮-間質轉化過程[9]。而本研究發現SOX5 在人口腔癌組織以及細胞中表達異常增加，且其表達水平

上調與患者的組織分型、臨床表現及生存率呈現正相關。本研究首次揭示了SOX5 在人口腔癌腫瘤組織中的表達，并與患者的臨床表現呈現出惡性相關，即SOX5 的表達水平增加可能導致了人口腔癌的惡化與預后不良。

為了檢測SOX5 表達水平改變的上游調控機制，筆者把研究目標轉向了miRNA 水平。miRNA 通過與靶基因mRNA 的3′-非翻譯區（3′-UTR）互補結合從而誘導靶基因mRNA 的直接降解，進而導致靶蛋白表達下降。目前的研究發現，超過30%的人類基因受miRNA 調控，而同一種miRNA 可以調控數百種mRNA 的降解[10]。miRNA通過調節靶向基因的表達來參與細胞增殖與分化、發育、細胞凋亡、炎癥及腫瘤發生與轉移等過程[10?11]。研究表明，miRNA 可以做為原癌基因或腫瘤抑制物來調節靶基因表達及旗下有信號通路的傳導[12]。越來越多的研究表明正常組織與癌組織中的miRNA 表達譜是不一樣的。研究發現，不同類型的組織或細胞中都有特異表達的miRNA，不同癌組織中的特異miRNA 表達譜可為臨床診斷與治療提供重要的信息。miRNA 參與口腔癌的發生與發展過程，越來越多的研究表明，針對特異miRNA，如miR-196a-5p 和miR-145，具有抑制口腔鱗狀細胞癌的潛在作用[13?14]，因此，對口腔癌中miRNA 的表達變化以及其調控基因的研究，有助于推進筆者對口腔癌發生發展分子機制的認識；同時miRNA 介導的治療為臨床治療提供了全新的藥物治療靶點依據。而本研究發現miR-219-5p 通過特異性與SOX5 基因的3′-UTR 區互補結合，在轉錄水平實現了對SOX5 的表達沉默，在人口腔癌中靶向調控了SOX5 的表達。

值得注意的是，miR-219-5p 做為新的腫瘤相關miRNA 被證實參與了多種腫瘤的發生與進展。miR-219-5p 在包括卵巢癌、胃癌以及結直腸癌等癌組織中的表達下調[15?19]。miR-219-5p 通過調節Twist/Wnt/β-catenin 信號通路來抑制表皮卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程[15]；而在胃癌中，miR-219-5p 通過調 節 LRH-1/Wnt/βcatenin 信號通路來抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程[16]；在結直腸癌中，miR-219-5p 通過下調calcyphosin 和PDGF 受體的表達來抑制癌細胞的增殖和侵襲過程[17?18]，同時可以通過下調LEBF1 的表達來抑制結直腸癌上皮-間質轉化及癌細胞轉移過程[19]。

結合本研究結果，miR-219-5p 在人口腔癌細胞株中的表達水平顯著下降、而SOX5 的表達增加，miR-219-5p 表達水平下降與SOX5 的表達水平增加呈現負相關，miR-219-5p 模擬物處理后可誘導人口腔癌細胞中SOX5 的表達增加，而將SOX5 mRNA 上miR-219-5p 靶向調控的潛在區域進行突變處理后可以消除miR-219-5p 對SOX5 的表達調控。這些結果提示miR-219-5p 可能通過特異性靶向結合SOX5 基因的3′非編碼區調控了SOX5 的表達；在口腔癌中miR-219-5p 的表達缺失，導致SOX5 表達失控而異常增加，可能與口腔癌的發生發展密切相關。本研究結果為口腔癌靶點基因的甄選及開展臨床靶向治療奠定了基礎。