甲狀腺乳頭狀癌基因突變與其侵襲性相關性研究

張 冉，楊 潔，馮恩梓，袁曉鳳，王 清

（昆明醫科大學第三附屬醫院頭頸外科，云南 昆明 650118）

甲狀腺癌是我國最常見的頭頸部腫瘤之一。2020 年全球新發甲狀腺癌病例數約為58 萬，發病率在所有癌癥中位列第11 位[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌（Papillary Thyroid Carcinoma PTC）是甲狀腺癌中最多見的類型。通過手術以及I131 綜合治療，PTC 預后總體較好，然而其中一部分PTC 依舊表現出較強的侵襲性，頸部淋巴結轉移、腺外侵犯不僅增加了手術難度，導致腫瘤組織不能夠完全切除，而且增加了腫瘤復發的風險以及影響患者的生存質量[2，3]。國內BRAF V600E 鑒別細針穿刺性質不明確的腫瘤應用已較為廣泛，然而基因突變關于預判PTC 侵襲性及預后方面的實際應用卻相對較少，然而這對預測患者預后有巨大的潛在價值，一項meta 分析顯示BRAF V600E 突變的PTC 患者淋巴結轉移的概率明顯提高[4]，還有研究聯合穿刺細胞學及BRAF V600E 突變也顯示BRAF V600E 突變的PTC 侵襲性更強，并在一定程度上能夠預測PTC 淋巴結轉移的發生[5]。本研究除了研究比較熱門同時也是應用比較成熟的BRAF V600E，還納入 了TERT，RET，RAS，TP53，CCDC6，NTRK，ETV6 共8 個基因進行分析，對各基因突變組與與野生型組的臨床病理特征進行對比，探究各基因突變與PTC 病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究回顧性納入2018 年4 月至2022 年4月就診于昆明醫科大學第三附屬醫院并且有完整的基因信息、病理資料、臨床資料的PTC 患者，納入標準：（1）本院行甲狀腺葉切除+中央區淋巴結清掃術且術后病理類型為甲狀腺乳頭狀癌；（2）有完整的臨床病理資料；（3）為初治病例，未接受過放化療；（4）無同期其他原發癌及遠處轉移。收集到樣本總數114 例，<55 歲91 例（79.8%），≥55 歲23 例（20.2%），年齡最小18 歲，最大78 歲，平均年齡43.11 歲，年齡中位數43 歲，男性23例（20.2%），女性91 例（79.8%）。

1.2 方法

1.2.1 基因檢測對術后腫瘤樣本核酸提取后進行文庫構建和探針捕獲，采用高通量測序技術（Next Generation Sequencing NGS）對21 個實體瘤相關突變進行檢測，包括BRAF、AKT1、KRAS、NRAS、HRAS、PIK3CA、CTNNB1、GNAS、TSHR、TERT、RET、NTRK1、ALK、PTEN、TP53、PAX8、RASAL1、PDGFRA、EIF1AX、ETV6、TSC2，其中BRAF、RET、NTRK、ALK、PAX8、ETV6 同時檢測融合突變的基因，例如：RET 同時檢測融合突變基因：CCDC6，TERT 同時檢測啟動子區域的基因，測序平臺為illumina，分析軟件為癌癥基因突變信息分析系統，基因檢測由昆明醫科大學第三附屬醫院醫院分子檢測中心完成，檢測報告由昆明醫科大學第三附屬醫院分子檢測中心出具。

1.2.2 回顧性收集符合入組標準患者的年齡（年齡分層按照第八版AJCC 分期系統分層）、性別、多發癌灶、侵犯包膜、中央區淋巴結轉移及淋巴結轉移數目，側頸淋巴結轉移及淋巴結轉移數目，T 分期，N 分期，M 分期，術前Tg-Ab，TPO-Ab等臨床病理資料，以及基因資料，以各基因突變組作為觀察組，野生型組作為對照組，以上臨床病理特征為觀察指標，對比各基因突變組與野生型組在臨床病理特征的差異（表1，表2）；多基因突變作為觀察組，單基因突變型作為對照組，以上述臨床病理特征為觀察指標，對比多基因突變與單基因突變臨床病理特征差異，探討基因突變數量與其侵襲性的關系（表3）；參照cN0 診斷標準：臨床觸診頸部未發現明顯淋巴結腫大或增大淋巴結最長徑不超過2 cm，且質地柔軟；常規影像學檢查，包括高頻超聲檢查及頸部CT 檢查等為未發現異常增大淋巴結，且淋巴結內無囊性變、點狀強回聲、皮髓質結構消失、分界不清等超聲現象，從cN0 患者中篩選出BRAF V600E 單基因突變及無基因突變的PTC 患者，以BRAF V600E突變作為觀察組，無基因突變作為對照組，中央區淋巴結轉移及淋巴結轉移數目為觀察指標，對比BRAF V600E 突變與無基因突變的PTC 在中央區淋巴結隱匿性轉移的差異。

表3 98 例單基因突變與多基因突變病理特征的單因素分析Tab.3 Single factor analysis of pathological characteristics of 98 cases of single gene mutation

1.3 統計學處理

采用SPSS25.0 統計軟件進行統計學分析，計數資料采用頻數（百分比表示），組間比較采用卡方檢驗，非正態分布的計量資料的比較采用非參數檢驗。以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

基因突變情況：21 個基因中有突變基因8 個：BRAF V600E 突變87 例（76.3%），其中單基因突變 81 例（71.1%），BRAF V600E+TERT 3 例（2.6%），BRAF V600E+TP53 2 例（1.7%），BRAF V600E+RAS 1 例（0.9%）；TERT 突變4 例（3.5%），其中 BRAF V600E+TERT 3 例，TERT+RETCCDC6 融合1 例（0.9%）；RAS 突變3 例（2.6%），均為NRAS 突變，其中2 例為單基因突變，BRAF V600E+RAS 1 例；RET 突變6 例（5.3%），其中單基因突變3 例，RET-CCDC6 融合2 例（1.7%），TERT+RET-CCDC6 融合1 例（0.9%）；CCDC6 突變3 例（3%），其中RET-CCDC6 融合2 例（1.7%），TERT+RET-CCDC6 融合1 例（0.9%）；TP53 突變3 例（2.6%），其中BRAF V600E+TP53 2 例（1.7%），TP53+ETV6-NTRK3 融合1 例（0.9%）；NTRK3 和ETV6 突變 3 例（2.6%），其中 TP53+ETV6-NTRK3 融合1 例（0.9%），另外2 例（1.7%）均為ETV6-NTRK3 融合突變。12 例（10.5%）為2 個及2 個以上多基因突變，單基因突變86 例（75.4%），16 例無基因突變。臨床病理資料：多發病灶54例（47.4%），包膜侵犯30 例（26.3%），中央區淋巴結轉移78 例（68.4%），側頸淋巴結轉移28 例（24.6%）。BRAFV600E 突變組與野生型組：突變組中央區淋巴結轉移占比較大，中央區轉移淋巴結轉移數量也較多（P<0.05），N1 占比較大，TPOAb 降低（P<0.05）；TERT 突變組與野生型組：TERT 突變組老年占比較大，男性占比較大，側頸淋巴結轉移患者占比較大，側頸淋巴結轉移數量較多，T 分期較晚（P<0.05）；RET 突變組與野生型組：側頸淋巴結轉移患者占比較大，側頸淋巴結轉移占比較大，T 分期較晚（P<0.05），NTRK3 與ETV6 均為融合突變，結果一致：突變組侵犯甲狀腺包膜占比較大（P<0.05）；RAS 突變組與野生型組：Tg-Ab 水平較低（P<0.05）；TP53，CCDC6 突變組與野生型組，差異均無統計學意義（P≥0.05）；多基因突變組與單基因突變組：多基因突變組侵犯包膜占比較大，側頸淋巴結轉移占比較大，側頸轉移淋巴結數量較多，M 分期較晚（P<0.05）；cN0 患者中BRAF V600E 突變組與無基因突變組，突變組中央區淋巴結轉移占比較大，中央區轉移淋巴結數目較多（P<0.05）。

3 討論

雖然甲狀腺癌相對其他惡性腫瘤預后較好，依舊有40%～90%的患者在初次手術中發現有頸部淋巴結轉移[6?7]，腫瘤侵犯、淋巴結轉移是甲狀腺癌預后的重要影響因素[8]，而且隨著PTC 發病率的不斷攀升，中晚期難治性PTC 也越來越常見[9]。2003 年Cohen 等[10]首次提出BRAF 基因與甲狀腺癌相關，隨著測序技術的發展，在PTC 中一些新的突變基因被發現，然而關于一些突變基因導致的PTC 生物學行為卻沒有明確的定論。相較于一代測序（Sanger Sequencing）而言，二代測序有成本低、通量高、速度快等優點[11]。本研究就是基于二代測序進行的PTC 相關基因突變與其生物學行為的討論，本次測序覆蓋了21 個基因，檢測了目標區域內的點突變，插入缺失突變，融合突變，拷貝數變異，全部患者114 例中檢測到基因突變8 個。BRAFV600E 突變是目前已知PTC中最常見的分子缺陷，本研究中BRAF V600E 突變型87 例，突變率達76.3%，觀察結果顯示其突變型較野生型更容易發生中央區淋巴結轉移，突變組73.6%，陰性組51.9%（P<0.05），多項研究也表明BRAFV600E 突變是PTC 中央區淋巴結轉移的危險因素[12?14]，有文獻報道[15]BRAFV600E突變是PTC 腫瘤多灶性及包膜外侵犯的危險因素，且相對于野生型表現出更強的側頸淋巴結轉移傾向，本研究結果顯示BRAF V600E 突變與PTC 多癌灶性、包膜侵犯以及側頸淋巴結并無顯著性關聯，這可能與一部分有多癌灶、包膜侵犯、側頸轉移的患者不愿意入組以及樣本量偏小有關。反觀TERT 突變型和RET 突變型比野生型均表現出更強的側頸淋巴結轉移的能力，T 分期也較晚，這兩方面2 者表現出一定的一致性，TERT 側頸淋巴結轉移，突變組75%，陰性組22.7%（P<0.05），側頸轉移淋巴結轉移數目，突變組5.50±7.14，陰性組1.15±2.48（P<0.05），除此以外，TERT 突變組相較陰性組診斷年齡更大，突變組60.75±12.82，陰性組42.46±11.01（P<0.05）。本研究中TERT 突變4 例，突變率為2.7%，相關研究也顯示存在TERT 突變的PTC 有更強的腺外侵犯能力，是影響T 分期和診斷年齡的重要因素[16]，有研究報道TERT 和高齡患者存在關聯[17]，與本研究結果一致。本研究中檢測到的RAS 突變均為NRAS 突變，且突變型與野生型也并未表現出明顯差異，本研究中，TP53 突變型與野生型在PTC 臨床病理特征均無顯著性差異，與國外一項研究一致[18]。

多基因突變中，3 例TERT 與BRAF V600E突變共存，TERT 突變已被證實與BRAF V600F突變存在協同相關[19]，相關研究[20]顯示BRAF V600E 聯合TERT 啟動子突變與PTC 碘治療療效不佳顯著相關，雖然本研究并未對碘治療展開討論，這也是TERT 突變型PTC 侵襲性強的一個表現，可為后續研究提供新的思路。有研究顯示BRAF V600E 和TERT 啟動子突變與淋巴結轉移、多灶性轉移、遠處轉移、甲狀腺外擴散顯著相關[21，22]，由于樣本量的限制，本研究并沒有做BRAF V600E 單基因突變與其他基因突變共存的對比，本研究把2 個及兩個以上基因突變歸為多基因突變組，與單基因突變比較觀察，觀察結果（表3）顯示多基因突變的 PTC 與包膜侵犯、側頸淋巴結轉移以及遠處轉移顯著相關，而中央區淋巴結轉移并沒有表現出顯著差異，包膜侵犯：單基因突變25.6%，多基因突變66.7%（P<0.05），側頸淋巴結轉移：單基因突變：18.6%，多基因突變：66.7%（P<0.05），M 分期也有顯著性差異，多基因突變較BRAF V600E 侵襲型更強也主要表現在這三方面，相關研究也顯示多基因突變可能比單基因突變有更強的侵襲性[23]。國內關于RETCCDC6 融合突變的相關報道較少，本研究3 例RET 基因與CCDC6 融合突變，與各病理特征相關性分析也并沒有統計學差異，為意義不明確的突變類型。ETV6-NTRK3 融合突變也少見報道，本研究中有3 名患者存在NTRK-ETV6 融合突變，在包膜侵犯上較陰性組更強，有研究報道ETV6-NTRK3 融合突變可能與輻射暴露有關[24]，2011年福島核泄漏福島核泄漏發生后，一項研究收集了2013 年至2016 年在福島醫科大學醫院接受PTC 手術的136 名患者，發現6 名患者ETV6-NTRK3 融合突變，突變率為4.3%[25]，本研究的突變率為2.1%，為本研究的2 倍。

PTC 轉移最多見的就是中央區淋巴結轉移，再通過中央區向側頸淋巴結轉移，很少一部分患者會直接轉移至側頸淋巴結，所以國內大部分PTC 切除原發灶的同時會同時進行預防性中央區淋巴結的清掃，然而中央區淋巴結清掃也存在一定的潛在風險，比如甲狀旁腺損傷導致術后低鈣血癥以及喉返神經損傷的風險增高。所以，對cN0 的PTC 患者是否行預防性中央區淋巴結清掃一直存在爭議[1]。本研究從所有患者中篩選出cN0 患者，以BRAF V600E 單基因突變以及無基因突變進行分組，以中央區淋巴結轉移以及中央區轉移淋巴結的數目進行比較，觀察發現有BRAF V600 突變的患者更容易發生中央區淋巴結轉移，中央區淋巴結轉移BRAF V600F 單基因突變組47.6%，無基因突變組9.1%（P<0.05），中央區轉移淋巴結數目BRAF V600F，突變組2.10 ±2.54，無基因突變組0.09±0.30（P<0.05），相關研究也顯示術前 BRAF V600E 突變陽性的患者發生隱匿性中央淋巴結轉移的可能性顯著更高[26]，見表4。該研究也有許多不足之處，樣本量太小，特別是一些罕見的基因型，讓統計分析較困難，未對甲狀腺乳頭狀癌進行進一步的分型，一些侵襲性高的病理亞型可能與某些基因的突變型有關，希望后續研究可以進一步擴大研究樣本量，以及對PTC 進一步細分亞型進行研究。

表4 53 例cN0 患者BRAF V600E 突變與無基因突變中央區淋巴結轉移的比較Tab.4 Comparison between braf v600e mutation and central lymph node metastasis without gene mutation.

綜上所述，基因突變和PTC 侵襲性存在相關性，PTC 中BRAFV600E 突變侵襲性主要表現為中央區淋巴結轉移率更高。多基因突變的侵襲性較BRAF V600E 突變更強，主要表現在甲狀腺包膜的侵犯率更高，側頸淋巴結轉移率更高，側頸轉移淋巴結數目較多，M 分期更晚。cN0 患者中存在BRAF V600E 突變的患者更容易發生中央區淋巴結的轉移，BRAF V600E 突變可為PTC 患者個體化治療提供一定的參考。