miR-485-5p靶向調節婆羅雙樹樣基因4/莫洛尼白血病毒插入點1對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移及凋亡影響

朱冠婭， 徐俊賜， 蔣 航， 薛春利， 李 挺， 楊祖賢

惠州市中心人民醫院 燒傷外科，廣東 惠州 516000

瘢痕疙瘩是皮膚纖維增生性疾病，常伴有疼痛、瘙癢、畸形甚至主要功能障礙，對患者危害極大。微小RNA(micro RNA，miRNA)在包括癌變、成纖維細胞活化與細胞外基質代謝等許多生物過程中作為表觀遺傳調節因子產生作用[1]。與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩病變組織中264種miRNA發生顯著改變，miR-21與miR-199a-5P均參與瘢痕疙瘩的增殖、遷移及凋亡[2-4]。miR-485-5p是一種腫瘤抑制因子，與多種癌癥細胞增殖、遷移及侵襲有關，包括胃癌、卵巢癌與肝癌癌[5]。婆羅雙樹樣基因4(sal-like protein 4，SALL4)為與瘢痕疙瘩過度形成相關的關鍵纖維化細胞因子[6]。莫洛尼白血病毒插入點1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site-1，BMI-1)基因蛋白是第一個被SALL4識別的蛋白質，作為基因轉錄調控元件發揮關鍵作用[7]。BMI-1表達增加可能導致器官的組織纖維化及疤痕形成。miR-485-5p可通過誘導正反饋回路激活SALL4/BMI-1信號傳導，這是腎纖維化的重要組成誘因[8]。本研究旨在探討miR-485-5p靶向調節SALL4/BMI-1對瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFBs)增殖、遷移及凋亡的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 Dulbecco改良的Eagle培養基、10%的胎牛血清、青霉素、鏈霉素(中國碧云天生物科技)、miR-485-5p pcDNA3.1低表達載體、空白載體(miR-NC)、噻唑藍染料、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、碘化丙啶、TRIzol試劑、二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒(中國Beyotime)、抗SALL4、BMI-1、GAPDH抗體的特異性一抗、辣根過氧化物酶偶聯的二抗、化學發光試劑(chemiluminescent reagents，ECL)試劑盒(中國Beyotime)等。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 選取自2021年5月至2022年5月惠州市中心人民醫院收治的21例瘢痕疙瘩患者為研究對象。其中，男性14例，女性7例；年齡17～54歲，平均年齡(33.02±9.16)歲；病程9～26個月，平均(14.54±4.72)個月。所有患者均符合2018年中國瘢痕疙瘩臨床治療指南中瘢痕疙瘩診斷標準[9]，未接受冷凍、激光、放射治療和糖皮質激素類藥物注射。本研究經醫院倫理委員會批準?；颊呔炇鹬橥鈺?。

1.2.2 細胞培養及分組 無菌條件下切取人瘢痕疙瘩組織，分離培養成KFBs細胞。將KFBs細胞分為miR-NC組(空白載體)、KFBs細胞組、miR-485-5p inhibitor組(miR-485-5p低表達)、miR-485-5p mimics組(miR-485-5p過表達)。miR-NC、miR-485-5p inhibitor、miR-485-5p mimics載體使用 Lipofectamine?2000 試劑于 37℃進行轉染。轉染后72 h后繼續實驗。

1.2.3 KFBs細胞活力檢測 應用噻唑藍比色法測定細胞增殖水平。細胞以5×103個/孔的初始密度，接種在96孔板上。細胞采用100 μl無菌MTT染料在37℃下染色4 h，然后去除培養基,加入DMSO。在參考波長570 nm處測量吸光度(optical density，OD)。

1.2.4 KFBs細胞凋亡測定 通過胰蛋白酶消化收集細胞，固定于70%乙醇中，離心，并在磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中孵育。離心后，將細胞離心、洗滌并在黑暗中標記15 min。采用流式細胞儀測量樣本，計算凋亡細胞百分比。

1.2.5 KFBs細胞侵襲水平測定 通過transwell測定法進行評估侵襲能力。將無血清培養基中1×105個細胞接種到涂有Matrigel插入物的上室中。將含有10%胎牛血清的培養基添加到下室中。孵育24 h后，用脫脂棉去除上膜殘留細胞。已侵襲入膜的細胞采用甲醇與0.1%結晶紫染色成像，并采用倒置顯微鏡計數。實驗獨立重復3次。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗 野生型(Wt)與突變型(Mut)SALL4 3′-非翻譯區域(untranslated region，UTR)分別克隆到psiCHECK-2熒光素酶報告質粒。將KFBs與SALL4 3′-UTR報告質粒、miR-485-5p模擬或對照共轉染。轉染后48 h，采用雙熒光素酶報告分析。

1.2.7 KFBs細胞SALL4、miR-485-5p表達水平測定 將細胞系制備成細胞懸液，添加TRIzol試劑提取細胞總RNA，使用逆轉錄酶從500 ng總RNA合成cDNA。采用miScript Reverse Transcription Kit將miRNA逆轉錄為cDNA。通過實時聚合酶鏈反應測量RNA表達。引物序列為：SALL4正向5′-TCGCGGCTAGTCGCTGCTGATCGATCGTAGCTGCC-3′，SALL4反向5′-TGGCTGATCGATCGATGCTAGCTAGCTGTCGC-3′；BMI-1正向5′-TGGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAG CTAGCTAGT-3′，BMI-1反向5′-TGGGCTAGCTAGCTAGCT AGCTAGCTAGC-3′；GAPDH正向，5′-TGCGCGATCG CGCAGCGATCGATCGATGCCC-3′，GAPDH反向5′-TGGGCT AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGCA-3′。采用2-ΔΔCt計算SALL4、BMI-1的相對表達水平。

1.2.8 KFBs細胞SALL4、BMI-1表達水平測定 通過二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒定量蛋白質。采用5%脫脂奶粉在PBS中封閉1 h后，將膜分別與SALL4、BMI-1一抗在4℃下孵育過夜。將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗孵育。結合抗體量用ECL檢測試劑檢測。測量條帶的相對光密度，比較4組KFBs細胞靶蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 4組KFBs細胞OD值、存活率比較 與miR-485-5p inhibitor組比較，KFBs細胞組、miR-NC組、miR-485-5p mimics組OD值、存活率均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組OD值、存活率均升高，miR-485-5p mimics組OD值、存活率均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組KFBs細胞OD值、存活率比較

2.2 4組KFBs細胞凋亡率比較 KFBs細胞組、miR-NC組、miR-485-5p inhibitor組、miR-485-5p mimics組細胞凋亡率分別為(6.09%±1.92%)、(6.74%±2.15%)、(0.92%±0.30%)、(9.80%±2.92%)。與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組細胞凋亡率降低，miR-485-5p mimics組細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 4組KFBs細胞遷移能力比較 KFBs細胞組、miR-NC組、miR-485-5p inhibitor組、miR-485-5p mimics組穿膜數分別為(896.21±24.89)個、(859.96±25.54)個、(1 625.49±23.51)個、(402.30±42.25)個。與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組穿膜數升高，miR-485-5p mimics組穿膜數降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組穿膜數降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 miR-485-5p對SALL4的靶向調節作用 螢光素酶結果顯示，miR-485-5p過表達可明顯降低SALL4-wt的熒光素酶活性，miR-485-5p低表達可明顯提升SALL4-wt的熒光素酶活性，miR-485-5p與SALL4存在靶向調節作用。

2.5 4組KFBs細胞miR-485-5p、SALL4、BMI-1 mRNA表達水平比較 與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組miR-485-5p降低，SALL4、BMI-1 mRNA升高，miR-485-5p mimics組細胞miR-485-5p升高，SALL4、BMI-1 mRNA降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組miR-485-5p升高，SALL4、BMI-1 mRNA降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組KFBs細胞miR-485-5p、SALL4、BMI-1 mRNA表達水平比較

2.6 4組KFBs細胞SALL4、BMI-1蛋白表達水平比較 與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組細胞SALL4、BMI-1蛋白升高，miR-485-5p mimics組細胞SALL4、BMI-1蛋白降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與miR-485-5p inhibitor組比較，miR-485-5p mimics組單細胞SALL4、BMI-1蛋白降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組KFBs細胞SALL4、BMI-1蛋白表達水平比較

3 討論

miRNA為高度保守的非編碼 RNA，調控細胞增殖、分化、發育、代謝和細胞凋亡，miRNA在腫瘤中充當抑癌基因或原癌基因。瘢痕疙瘩是異常增生，與良性腫瘤相似，在真皮細胞中呈現舌狀前進邊緣，類似于侵襲性腫瘤生長[10]。miRNA參與調節成纖維細胞的生物學表型以參與瘢痕疙瘩的發病機制[10]。miR-21在瘢痕疙瘩組織中上調，抑制miR-21可加速KFBs凋亡。作為一種高度保守的miRNA，miR-485-5p參與了細胞內多種生物學事件的調節，包括細胞周期停滯、促進細胞衰老、誘導細胞凋亡、阻止細胞遷移。

本研究結果顯示，與KFBs細胞組、miR-NC組比較，miR-485-5p inhibitor組OD值、存活率、穿膜數升高，miR-485-5p mimics組OD值、存活率、穿膜數降低(P<0.05)。這說明，miR-485-5p顯著抑制KFBs增殖、遷移和促進細胞凋亡。miRNA主要通過作用于靶基因作為腫瘤抑制基因或癌基因。有研究發現，SALL4的3′UTR含有與miR-485-5p互補的核苷酸序列，miR-485-5p可能靶向調節SALL4的表達。既往研究證明，SALL4 為纖維化疾病中的關鍵信號蛋白，參與器官組織纖維化和病理性傷口愈合進展。然而，SALL4 在調節瘢痕疙瘩形成中的確切作用仍然未知。BMI-1是一種促纖維化劑，可通過經典的Smads和Erk磷酸化途徑促進細胞外基質，尤其是膠原蛋白的合成[11-13]。SALL4誘導BMI-1磷酸化并增加人Ⅲ型膠原表達。既往研究表明，磷酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2在BMI-1介導的膠原合成中發揮協同作用，這是由BMI-1在一些纖維化疾病細胞(如人真皮成纖維細胞和肌成纖維細胞)中過表達所引起[14-15]。本研究熒光素酶報告基因檢測結果表明，miR-485-5p mimic可降低SALL4野生型的熒光素酶活性。這提示，miR-485-5p可與3′ SALL4 靶向結合位點的UTR。此外，上調KFBs中miR-485-5p的表達后，SALL4蛋白的表達下調，下調miR-485-5p的表達后，SALL4蛋白的表達上調，進一步證實了KFBs中miR-485-5p可以負調節SALL4的表達。有研究發現，血管平滑肌細胞中的BMI-1/SALL4以時間依賴性方式影響蘇氨酸蛋白激酶的磷酸化，并因SALL4的過表達而增強[16-20]。本研究結果發現，與KFBs細胞組比較，miR-485-5p inhibitor組miR-485-5p降低，SALL4、BMI-1 mRNA升高，miR-485-5p mimics組細胞miR-485-5p升高，SALL4、BMI-1 mRNA降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。這說明，miR-152-5p靶向調節SALL4，同時抑制BMI-1表達，進而抑制了SALL4/BMI-1通路的激活。

綜上所述，miR-485-5p過表達可顯著抑制KFBs增殖、遷移，促進細胞凋亡，其機制可能與miR-152-5p靶向調節SALL4，同時抑制BMI-1表達，進而抑制SALL4/BMI-1通路的激活有關。