LncRNA MALAT-1靶向microRNA-370-3p調節Akt通路對肺癌細胞生物學行為影響的機制研究*

李亮，李建忠，張丹杰，馬躍峰，李少民

（西安交通大學第二附屬醫院 胸外科，陜西 西安 710004）

肺癌是全世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤，其中85%的肺癌患者為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1]。肺癌的臨床治療以手術、放化療、靶向治療為主，這些方法雖然在一定程度上能延長患者的生存期，但肺癌患者的預后仍然不容樂觀，文獻報道其5年總生存率僅為15%左右[2]，因此有必要對肺癌的發病機制進行深入研究并尋找新的靶點。長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA,LncRNA）近年來被發現參與多種惡性腫瘤的增殖和轉移，多個文獻報道LncRNA 在乳腺癌[3]、肝癌[4]、胰腺癌[5]、肺癌[6]等多種癌組織中高表達，LncRNA 肺腺癌轉移相關轉錄因子-1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT-1）是肺癌的特異性標志物，LncRNA MALAT1 高表達是肺癌不良預后的預測因素之一[7]。微小RNA（microRNA,miR）是一種廣泛存在于細胞中的非編碼RNA，miR 是LncRNA MALAT1 的靶基因之一，LncRNA MALAT1 可以通過與有靶向結合位點的miR 靶基因相結合，調節其轉錄或翻譯水平，進一步參與腫瘤的發生發展。已有相關研究[8]報道LncRNA 可以通過與下游miR 結合調控惡性腫瘤的發生、發展。Akt 激酶信號通路途徑是影響肺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的重要通路。目前關于LncRNA MALAT1 與miR-370-3p 在肺癌中是否存在相互作用尚不可知，本研究擬觀察LncRNA MALAT1是否可以通過靶向結合miR-370-3p 影響肺癌細胞的生長與凋亡，并檢測下游Akt 通路蛋白的表達變化，探究其是否對該通路存在影響作用，以期為肺癌的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人肺癌細胞A549 由上海細胞資源中心提供，DMEM 培養液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購自美國Thermofisher 公司，熒光素酶檢測試劑盒購自上海漢恒生物科技有限公司，LncRNA MALAT-1 siRNA（si-MALAT-1）及其陰性對照（si-MALAT-1-NC）、pcDNA-MALAT-1、miR-370-3p 模擬物（miR-370-3p mimic）和抑制劑（miR-370-3p inhibitor）及其陰性對照序列（miR-NC）購自美國Sigma-Alrdich 公司，轉染試劑盒購自美國Thermo 公司，Akt 單克隆抗體、p-Akt 單克隆抗體、PI3K 單克隆抗體、p-PI3K 單克隆抗體購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶購自北京中杉金橋公司，膜聯蛋白（Annexin）V-FITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。主要儀器：二氧化碳培養箱購自常州恒隆儀器有限公司，酶標儀購自美國Thermo 公司，BSC-1100IIA2-X 生物安全柜購自濟南歐萊博科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人肺癌細胞A549 培養于含有10% FBS 的DMEM 培養液中，置于37℃、5%二氧化碳恒溫箱中，當細胞生長至融合度80%以上開始傳代實驗。收集對數期A549 細胞制成細胞懸液，并接種在24 板孔中。

1.2.2 分組①抑制LncRNA MALAT-1 或過表達miR-370-3p 對肺癌細胞增殖、遷移、凋亡及Akt 通路的影響：隨機分為對照組（Control 組，不轉染）、si-NC組（轉染si-MALAT-1 NC）、si-MALAT-1 組（轉染si-MALAT-1）、mi-NC 組（轉染miR-NC）、miR-370-3p組（轉染miR-370-3p mimic）。 ②抑制LncRNA MALAT-1 并干擾miR-370-3p 對肺癌細胞增殖、遷移、凋亡及Akt 通路的影響：隨機分為對照組（Control 組，不轉染）、si-NC 組（轉染si-MALAT-1 NC）、si-MALAT-1 組（轉染si-MALAT-1）、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組（同時轉染si-MALAT-1 和anti-miR-NC）、si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組（同時轉染si-MALAT-1 和anti-miR-370-3p）。所有轉染操作嚴格按照Lipofectmine 2000 說明書進行，各組細胞轉染6 h 后更換新的含有青霉素/鏈霉素的10%FBS DMEM 培養液繼續培養72 h，分別于24 h、48 h、72 h 進行細胞收集。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測首先使用預測軟件TargetScan 和miRanda 進行靶基因預測，檢查LncRNA MALAT-1 與miR-370-3p 是否存在結合位點，再分別構建MALAT-1 野生型（MALAT-1WT_1uc）與突變型（MALAT-1MUT_1uc）熒光素酶報告基因質粒。然后將培養的A549 細胞接種于24 孔板，繼續培養過夜，待完全貼壁后采用脂質體轉染法進行轉染，分別將帶有MALAT-1WT_luc、MALAT-1MUT_luc 雙報告基因質粒和miR-370-3p、miR-NC 轉染至A549細胞中，轉染48 h 后檢測螢火蟲熒光素酶（Firefly）和海腎（Renilla）的熒光強度，以二者的比值（Firefly/Renilla）衡量相對活性，反映LncRNA MALAT-1 和miR-370-3p 的結合情況。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測LncRNA MALAT-1、miR-370-3p 表達細胞培養液1 000 r/min 離心5 min，取下層細胞沉淀，加入1 mL TRIzol 液吹打均勻后移入EP 管，室溫放置5 min，然后12 000 r/min 離心5 min，取上清液。測定純度時加入Buffer 溶解，計算A260/A280 比值，比值處于1.6～1.8，最后調整RNA 濃度至100 μg/mL。按照試劑盒說明書配制總反應體系20 μL（2 μL 逆轉錄引物、2 μL 逆轉錄酶、2 μL dNTPs、0.5 μL RNA 酶抑制劑、4 μL RT Buffer、9.5 μL ddH2O）進行逆轉錄，逆轉錄條件：42℃逆轉錄30 min、85℃ 酶失活反應5 min，置入-20℃冰箱冷凍保存。再進行qRT-PCR，按照試劑盒說明書配制總反應體系20 μL（2 μL 正向引物、2 μL 反向引物、2 μL cDNA、10 μL PCR master mix、4 μL ddH2O），反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，58℃延伸30 s，共40 個循環。設置3 個重復孔，GAPDH 為內參對照，以2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲與遷移侵襲實驗：采用含0.1% FBS 的DMEM 培養基培養細胞24 h，調整細胞濃度為1×106/mL，接種于含有基質膠的Transwell 小室的上室中，在下室中加入500 μL 含有10% FBS 的DMEM 培養基，37℃、5%二氧化碳培養箱中培養24 h，取出小室，棄去培養液，PBS 緩沖液沖洗3 遍，多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，棉簽擦去上層未遷移細胞，PBS 緩沖液沖洗3 遍，顯微鏡下隨機選取10 個視野進行細胞計數。遷移實驗：用不含FBS 的DMEM 培養基重懸制備細胞懸液，將其重懸后接種于Transwell 小室的上室中，其他操作與侵襲實驗相同。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡取各組細胞加入0.25%胰蛋白酶消化并制成細胞懸液，以每管1×106個細胞加入流式離心管，培養48 h 后，加入10 μL Annexin V-FITC，混勻后在冰上避光孵育30 min，再加入5μL PI，渦旋混勻，冰上孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7 MMT法檢測細胞增殖活性取對數期細胞加入0.25%胰蛋白酶消化并制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL，接種于96 孔板（每孔100 μL），培養48 h 后于每孔中加入20 μL 的MTT 溶液（5 mg/mL），室溫下孵育4 h，再加入150 μL 的DMSO，震蕩10 min，用酶標儀讀取490 nm 波長處各孔的光密度度值（OD）。 細胞存活率=（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）×100%。

1.2.8 Western blotting 法檢測Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白相對表達量Tris 法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，配置10% SDS-PAGE 凝膠，取20 μL 樣品上樣，120 V 垂直電泳60 min，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，顯影后進行曝光洗片，以β-actin 為內參，采用Image J 軟件計算每個條帶的光密度值，以目的蛋白的灰度值/GAPDH 灰度值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制LncRNA MALAT-1或過表達miR-370-3p各組LncRNA MALAT-1mRNA、遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率的比較

qRT-PCR 結果顯示，細胞遷移、侵襲及凋亡實驗結果顯示，Control 組、si-NC 組及si-MALAT-1組的LncRNA MALAT-1 mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），與Control組和si-NC 組比較，si-MALAT-1 組的LncRNA MALAT-1 mRNA 相對表達量下降（P<0.05），見表1。細胞遷移、侵襲及凋亡實驗結果顯示，Control 組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、miR-NC 組及miR-370-3p組的遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；與Control 組比較，si-MALAT-1 組和miR-370-3p 組遷移細胞數、侵襲細胞數減少（P<0.05），細胞凋亡率升高（P<0.05），與miR-NC 組比較，miR-370-3p組遷移細胞數、侵襲細胞數減少（P<0.05），細胞凋亡率升高（P<0.05）。見表2 和圖1～3。

圖1 各組A549細胞的遷移情況 （結晶紫染色×200）

表2 各組LncRNA MALAT-1mRNA、遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率的比較 （±s）

表2 各組LncRNA MALAT-1mRNA、遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率的比較 （±s）

注：①與Control組比較，P <0.05；②與si-NC組比較P <0.05；③與miR-NC組比較P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組miR-NC組miR-370-3p組F 值P 值LncRNA MALAT-1 mRNA 1.00±0.02 0.98±0.03 0.42±0.06①②--9.206 0.021遷移細胞數/個156.39±5.41 150.67±6.52 64.36±4.73①②150.84±5.23 52.68±4.35①③22.015 0.001侵襲細胞數/個120.20±6.38 125.88±7.16 70.53±5.62①②130.99±6.81 60.77±5.06①③18.902 0.002細胞凋亡率/%4.08±0.33 4.03±0.17 12.92±0.21①②4.79±0.33 11.96±1.17①③12.569 0.009

2.2 各組不同時間點細胞增殖活性的比較

MMT 法檢測結果顯示，培養24 h、48 h、72 h 后，Control 組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、miR-NC 組及miR-370-3p 組的細胞增殖活性比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞增殖活性有差異（F=9.308，P=0.020）；②各組細胞增殖活性有差異（F=11.308，P=0.013）；③各組細胞增殖活性變化趨勢有差異（F=7.338，P=0.036）。見表3。

表3 各組不同時間點細胞增殖活性的比較 （±s）

表3 各組不同時間點細胞增殖活性的比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較P <0.05；③與miR-NC組比較，P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組miR-NC組miR-370-3p組24 h 0.35±0.04 0.34±0.03 0.32±0.05 0.36±0.08 0.31±0.09①③48 h 0.67±0.07 0.64±0.07 0.44±0.06①②0.62±0.10 0.39±0.11①③72 h 1.33±0.16 1.29±0.15 0.75±0.11①②1.27±0.22 0.68±0.14①③

圖2 各組A549細胞的侵襲情況 （結晶紫染色×200）

圖3 各組A549細胞的凋亡情況

2.3 各組A549細胞的Akt通路相關蛋白表達比較

Western blotting 結果顯示，Control 組、si-NC組、si-MALAT-1 組、miR-NC 組及miR-370-3p 組細胞p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；與Control 組比較，si-MALAT-1 組和miR-370-3p 組細胞的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量降低（P<0.05），與miR-NC 組比較，miR-370-3p 組細胞的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量降低（P<0.05）。見表4 和圖4。

表4 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量的比較 （±s）

表4 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量的比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較P <0.05；③與miR-NC組比較，P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組miR-NC組miR-370-3p組F 值P 值p-Akt/Akt 1.16±0.04 1.08±0.06 0.46±0.09①②0.99±0.02 0.28±0.07①③6.569 0.008 p-PI3K/PI3K 0.97±0.06 0.93±0.18 0.33±0.05①②0.88±0.09 0.25±0.04①③7.235 0.003

圖4 各組A549細胞的Akt通路相關蛋白的表達

2.4 LncRNA MALAT-1對miR-370-3p的靶向調控作用

TargetScan 靶基因預測發現LncRNA MALAT-1與miR-370-3p 存在結合位點（見圖5）。熒光素酶報告基因實驗檢測發現，MALAT-1WT_1uc+Control組、MALAT-1WT_1uc+miR NC 組、MALAT-1WT_1uc+miR-370-3p 組相對熒光強度分別為（1.00±0.12）、（0.98±0.11）、（0.35±0.09），經方差分析，差異有統計學意義（F=7.521，P=0.008）；與MALAT-1WT_1uc+Control 組和MALAT-1WT_1uc+miR NC 組比較，LncRNA MALAT-1WT_1uc+miR-370-3p 組的相對熒光強度降低（P<0.05）。MALAT-1MUT_1uc+Control 組、MALAT-1MUT_1uc+ miR NC 組、 MALAT-1MUT_1uc+miR-370-3p 組相對熒光強度分別為（1.02±0.14）、（0.93±0.10）、（0.96±0.13），經方差分析，差異無統計學意義（F=1.013，P=0.092）。

圖5 LncRNA MALAT-1與miR-370-3p的結合位點

進一步qRT-PCR 檢測發現，Control 組、si-NC組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的miR-370-3p mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=12.332，P=0.006）；與Control 組比較，si-MALAT-1 組的miR-370-3p mRNA 相對表達量升高（P<0.05）；與si-MALAT-1 組比較，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的miR-370-3p mRNA 相對表達量降低（P<0.05）。見表5。

表5 各組miR-370-3p mRNA、遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率的比較 （±s）

表5 各組miR-370-3p mRNA、遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率的比較 （±s）

注：①與Control組比較，P <0.05；②與si-NC組比較，P<0.05；③與si-MALAT-1組比較P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組si-MALAT-1+anti-miR-NC組si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組F 值P 值miR-370-3p mRNA 1.00±0.03 1.01±0.01 4.84±0.09①②4.77±0.05①②2.29±0.04①②③12.332 0.006遷移細胞數/個95.22±7.63 93.79±7.55 30.60±3.02①②33.69±4.11①②60.35±3.62①②③22.891 0.001侵襲細胞數/個100.44±5.93 98.35±6.64 30.60±4.12①②24.39±5.04①②50.02±4.91①②③23.298 0.000細胞凋亡率/%2.63±0.16 3.04±0.28 9.27±0.68①②7.94±0.54①②3.87±0.25①②③7.231 0.036

2.5 抑制LncRNA MALAT-1并干擾miR-370-3p各組miR-370-3p 表達、遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率的比較

細胞遷移、侵襲及凋亡實驗結果顯示，Control組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+antimiR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的遷移細胞數、侵襲細胞數及細胞凋亡率比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；與Control組比較，si-MALAT-1 組遷移細胞數、侵襲細胞數減少（P<0.05），細胞凋亡率升高（P<0.05）。與si-MALAT-1 組比較，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組的遷移細胞數、侵襲細胞數增加（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05）。見表5 和圖6～8。

圖6 各組A549細胞的遷移情況 （結晶紫染色×200）

圖7 各組A549細胞的侵襲情況 （結晶紫染色×200）

圖8 各組A549細胞的凋亡情況

2.6 各組不同時間點細胞增殖活性的比較

培養24 h、48 h、72 h 后，Control 組、si-NC組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的細胞增殖活性比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的細胞增殖活性有差異（F=8.137，P=0.027）；②各組細胞增殖活性有差異（F=13.108，P=0.005）；③各組細胞增殖活性變化趨勢有差異（F=9.086，P=0.022）。見表6。

表6 各組不同時間點細胞活性比較 （±s）

表6 各組不同時間點細胞活性比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較，P <0.05；③與si-MALAT-1組比較，P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組si-MALAT-1+antimiR-NC組si-MALAT-1+antimiR-370-3p組24 h 0.37±0.03 0.33±0.06 0.34±0.08 0.36±0.08 0.35±0.10 48 h 0.85±0.09 0.81±0.08 0.48±0.07①②0.52±0.11①②0.70±0.14①②③72 h 1.56±0.22 1.61±0.27 0.83±0.16①②0.80±0.20①②1.15±0.17①②③

2.7 各組A549細胞的Akt通路相關蛋白表達的比較

Western blotting 結果顯示，Control 組、si-NC 組、si-MALAT-1 組、si-MALAT-1+anti-miR-NC 組及si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；與Control 組比較，si-MALAT-1組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量降低（P<0.05）。與si-MALAT-1 組比較，si-MALAT-1+antimiR-370-3p 組的細胞p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量升高（P<0.05）。見表7 和圖9。

表7 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量的比較 （±s）

表7 各組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量的比較 （±s）

注：①與Control 組比較，P <0.05；②與si-NC 組比較P <0.05；③與si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組比較P <0.05。

組別Control組si-NC組si-MALAT-1組si-MALAT-1+anti-miR-NC組si-MALAT-1+anti-miR-370-3p組F 值P 值p-Akt/Akt 0.93±0.10 1.02±0.08 0.23±0.06①②0.26±0.04①②0.48±0.09①②③8.299 0.008 p-PI3K/PI3K 0.71±0.11 0.64±0.13 0.21±0.07①②0.23±0.09①②0.38±0.11①②③9.236 0.006

圖9 各組A549細胞的Akt通路相關蛋白的表達

3 討論

LncRNA 是一種非編碼RNA，其長度大約為200 個核苷酸，研究[9]發現LncRNA 不僅參與人類的生長發育，還與腫瘤等多種疾病的發生、發展密切相關。肺癌是一種極其復雜的疾病，癌變過程涉及多種基因和蛋白的表達變化，這種變化不僅可以影響癌細胞的增殖和凋亡，還能影響其侵襲和遷移。越來越多的體外研究和臨床研究均發現LncRNA 可以通過多通路、多水平、多機制、多聯合等多種途徑干預腫瘤細胞的生長、浸潤、轉移以及耐藥性[10-12]。LncRNA-MALAT1 是一種廣泛表達于真核生物的LncRNA，研究發現LncRNAMALAT1 在包括肺癌在內的多種癌癥中呈高表達，被認為是一種促癌基因。非小細胞肺癌（NSCLC）是世界上發病率和病死率最高的最常見惡性腫瘤之一。張進儒等[13]經過臨床研究發現LncRNAMALAT1 不僅與肺癌密切相關，其高表達還是NSCLC 不良預后的危險因素。MA 等[14]經過體外細胞培養發現A549 細胞可以高表達LncRNAMALAT1，以上研究都提示LncRNA-MALAT1 與肺癌密切相關。miR 是一種單鏈非編碼RNA，現已有不少證據[15-16]表明LncRNA 可以通過靶向結合位點與多種miR 基因靶向結合，通過競爭性抑制降低miR 的表達，以此來調控下游靶基因的表達。但關于LncRNA-MALAT1 與miR-370-3p 之間是否存在靶向作用還不清楚。

WANG 等[17]通過體外細胞實驗發現miR-370-3p參與了NSCLC 的進展，為了探究LncRNA-MALAT1、miR-370-3p 與肺癌之間的相互關系，本研究選取A549 NSCLC 細胞系進行體外實驗，結果發現抑制LncRNA MALAT-1 或過表達miR-370-3p 都能抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時增加癌細胞的凋亡，提示LncRNA MALAT-1 和miR-370-3p 都能影響肺癌細胞的生物學行為，這為肺癌的臨床研究提供了新的靶點。但是關于LncRNA MALAT-1 和miR-370-3p之間的相互關系及具體的作用機制尚不清楚。通過靶基因預測筆者發現LncRNA MALAT-1 與miR-370-3p 存在結合位點，為了探究LncRNA MALAT-1是否對miR-370-3p 存在靶向調控作用，本研究進一步進行了熒光素酶報告基因實驗，發現野生型LncRNA MALAT-1+miR-370-3p的熒光強度顯著低于突變型，提示LncRNA MALAT-1 對miR-370-3p 有靶向負調控作用，RT-PCR 結果發現抑制MALAT-1 后miR-370-3p 表達顯著升高，pc-DNA-MALAT-1 組miR-370-3p 表達顯著下降，這進一步證實了LncRNA MALAT-1 對miR-370-3p 具有負調控作用。與單純抑制LncRNA MALAT-1 相比，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 在培養48 h 和72 h 時A549 細胞的增殖以及遷移和侵襲顯著升高但仍顯著低于si-NC 組，si-MALAT-1+anti-miR-370-3p 組的細胞凋亡率則顯著下降但仍然顯著高于si-NC 組，這更加印證了MALAT-1和miR-370-3p之間的負向關系。

PI3K/Akt 信號途徑（又稱為Akt 通路）是一條與細胞增殖和凋亡密切相關的絡氨酸激酶級聯信號傳導途徑，多項研究[18-19]證實該途徑參與肺癌的發生、發展和預后。本研究中，抑制LncRNA MALAT-1或過表達miR-370-3p 時p-Akt 和p-PI3K 表達均顯著下降，但Akt 和PI3K 無顯著變化，同時抑制LncRNA MALAT-1 和干擾miR-370-3p 時，p-Akt 和p-PI3K 表達均有所上升但仍顯著低于單純抑制LncRNA MALAT-1。 說明單純沉默 LncRNA MALAT-1 或提高miR-370-3p 的表達都能抑制Akt和PI3K 的磷酸化，而沉默LncRNA MALAT-1 并干擾miR-370-3p，對Akt 和PI3K 磷酸化的抑制作用被減弱。PI3K/Akt 信號通路的磷酸化能促進惡性腫瘤的發生與發展，WU 等[20]發現可以通過調節LncRNA WT1-AS 來調控其靶向基因miR-494-3p，并最終抑制PI3K/Akt 通路的激活，起到抑制A549 和NCIH1975 細胞的增殖、遷移和侵襲作用。磷酸化的PI3K/Akt 可以下調促凋亡蛋白Bax 的表達以及抗凋亡蛋白Bcl-2 的降解，發揮抑制腫瘤細胞凋亡的作用，還可以通過激活酶激酶-3β 來加重癌細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，LncRNA MALAT-1 可以與miR-370-3p 靶向結合且對miR-370-3p 的表達具有負調控作用。抑制LncRNA MALAT-1 可以上調miR-370-3p 的表達，抑制549細胞的增殖、遷移及侵襲能力，促進A549細胞的凋亡，并下調Akt通路蛋白的磷酸化。