代謝組學在中醫防治冠心病中的應用*

呂雙宏，趙夢竹，王恒和

天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease，CHD）是由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血、缺氧或壞死而引發的心臟病。近年來，隨著老齡化進程的加快，加之不良的生活方式，我國CHD 的發病率和死亡率呈持續上升狀態，目前CHD 作為獨立危險因素，已成為我國多個省市心血管疾病的首位死亡原因［1］。

中醫學將CHD 歸屬于“胸痹”“心痛”“真心痛”等范疇，采用辨證論治進行個體化針對性治療。近年來，證候客觀化逐漸成為學術研究熱點。代謝組學是繼基因組學、蛋白組學發展起來的新興技術，其思路與中醫思維模式相吻合，主要致力于研究機體內源性代謝產物及通路情況［2］。隨著代謝組學研究的興起，此項技術因其獨特優勢在CHD 辨證及治療方面得到廣泛應用，并取得積極成效，為CHD 的診療提供了客觀化依據。筆者現就代謝組學在CHD 中醫防治方面的應用綜述如下，以期為臨床治療提供參考。

1 代謝組學的概念及發展淵源

代謝組學是20 世紀90 年代中期發展起來的一門新興組學技術，是研究代謝組在某一時刻細胞內代謝物的集合的一門學科，是系統生物學的重要組成部分。1999年，NICHOLSON等［3］首次提出“metabonomics”的概念，2000年，FIEHN等［4］又重新提出了“metabolomics”的概念，并將其研究目的分為代謝物靶標分析、代謝輪廓（譜）分析、代謝組學、代謝指紋分析。這門學科致力于對機體相對分子量在1000 Da以下的內源性小分子物質的變化及規律進行研究，其分析手段包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜串聯質譜儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、超高壓液相色譜串聯質譜儀、高分辨氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF/MS）等技術體系和相應的模式識別技術體系［5］。隨著現代技術完善及方法創新，代謝組學現已廣泛應用于生物學、植物學、毒理學、臨床疾病診斷、藥物研究等諸多領域［6］。

2 代謝組學在CHD不同證型臨床試驗中的應用

2.1 心血瘀阻證鄭景輝等［7］采用相關代謝通路分析平臺對CHD 心血瘀阻患者血漿代謝產物路徑進行可視化分析，檢測出有9 個代謝產物主要通過15 條代謝路徑參與到病理過程中，具有統計學意義的通路包括糖酵解和糖異生、丙酸代謝、脂肪酸生物合成等。陳夏等［8］使用生物學技術對CHD 心血瘀阻證患者尿液代謝物進行分析顯示，其中有6 個差異性代謝產物參與了10 條代謝路徑，最終測定得出，參與病理過程的通路主要為半乳糖代謝、酮體的合成和降解通路。簡維雄等［9］運用GC-MS鑒定CHD心血瘀阻證患者尿液代謝產物譜，對不同組代謝產物進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）認為，心血瘀阻證患者尿液代謝標記物主要有葡萄糖、甘油、木糖醇、馬尿酸、油酸酰胺、丙酮等。

2.2 先天伏寒證/寒凝心脈證魏巖等［10］利用NMR 技術研究CHD 心絞痛先天伏寒兼心血瘀阻證患者血液的代謝標志物，與非先天伏寒兼心血瘀阻證患者相對照，通過PLS-DA 方法分析指出，兩組存在明顯差異的代謝產物有丙氨酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、脂類化合物、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、高密度脂蛋白等，可對兩組患者進行有效區分，暗示代謝組學技術在一定程度上為中醫辨證分型提供了新參考。

2.3 痰濁證（痰阻心脈證/脾虛痰濁證）LU等［11］研究發現，CHD 痰阻心脈證患者代謝途徑主要表現為脂質代謝紊亂。劉羽茜［12］運用液相色譜與質譜聯用技術（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）對CHD 穩定型心絞痛脾虛痰濁證患者和健康人進行血清代謝組學檢測，采用PCA 和PLS-DA 分析觀察代謝標記物的差異，結果顯示CHD 穩定型心絞痛脾虛痰濁證患者的組的亮氨酸、組氨酸、維生素A 等6 種代謝物含量均大于健康組，次黃嘌呤、肌苷、阿糖次黃嘌呤等20 種代謝物含量均小于健康人，此項研究為CHD 穩定型心絞痛脾虛痰濁證內在病理狀態的探索提供了科學依據。

2.4 心氣虛弱證史琦等［13］采用氫核磁共振（H1-nuclear magnetic resonance，H1-NMR）檢測技術，對45 例CHD 患者和15 名正常人的血漿代謝產物進行PLS-DA、VIP及t檢驗/非參數檢驗分析，篩選出氣虛證患者高表達的代謝產物，包括乙酰谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸和肉堿等，其代謝過程有氨基酸、糖、脂質、能力代謝、凝血過程及其他代謝過程，上述特異性代謝產物及途徑可對CHD 氣虛證患者進行有效識別。

2.5 氣陰兩虛證李宜［14］基于代謝組學NMR 技術，對CHD 心絞痛患者與健康對照組間、CHD 心絞痛各中醫證候間的差異代謝產物進行檢測，并通過PCA 和PLS-DA 分析結果，發現CHD 氣陰兩虛證患者特異性代謝標志物變化主要為：丙氨酸、乳酸、葡萄糖、p-葡萄糖、脂類、不飽和脂肪酸、高密度脂蛋白的含量升高，氧化三甲胺、纈氨酸、膽堿磷酸的含量降低，此變化的特異性代謝產物可進一步證實成為CHD中醫辨證分型的的基礎物質。

2.6 氣虛血瘀證陳浩等［15］通過LC-MS 的方法，檢測CHD心絞痛氣虛血瘀證的血清、尿液的內源性代謝物，采用PCA 和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）指出，氣虛血瘀證的代謝標記物有天冬氨酰蛋氨酸和半胱氨酸亞磺酸，客觀化表現為缺少生物素、賴氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨膽酸。朱明丹等［16］從系統生物學角度探究心肌梗死恢復期氣虛血瘀證患者代謝物譜發現，血磷脂酰膽堿、亞油酸、花生四烯酸、鞘氨醇類物質的代謝水平呈現特異性，患者機體可能存在能量、磷脂及脂肪酸代謝紊亂。

3 代謝組學在CHD不同證型動物模型中的應用

目前，將代謝組學應用到CHD 不同證型動物模型中的研究相對匱乏，尚處于探索階段。總結文獻發現，現有的大部分研究成果均凸顯出代謝組學在動物模型應用中的積極作用，但由于造模方式不同，動物所表達的特異性生物指標也會有所差異，這給代謝物質的篩選帶來了一定挑戰，今后臨床需要探索更規范、更科學的手段來突破這一難關。

王勇等［17］構造慢性心肌缺血氣虛血瘀證小型豬模型，采用GC-MS 和模式識別技術分析其代謝物及代謝物譜群的變化，結果顯示檸檬酸、葡萄糖、硬脂酸、棕櫚酸、甘油、醋酸等化合物濃度呈高表達狀態，具備特異性。簡維雄等［18］復制急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）心血瘀阻證大鼠模型，運用GC-MS 檢測，對代謝產物含量的變化進行PCA 和OPLS-DA 分析發現，大鼠AMI 心血瘀阻證與心肌組織特征性代謝產物有蘋果酸、谷氨酸、甘氨酸、葡萄糖、延胡索酸、尿素、吡喃半乳糖、乳酸、丙氨酸、酪氨酸等，代謝途徑與缺氧后的糖代謝紊亂顯著相關。徐利云［19］建立胸痹氣虛血瘀、氣滯血瘀、寒凝氣滯3 種證型大鼠模型，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜檢測技術（ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）將預處理數據進行PCA 和PLS-DA 分析，再利用OPLS-DA 鑒定各證型組潛在的生物標志物，其中與氣滯血瘀型相關的潛在標志物有28 個，其主要代謝途徑有半胱氨酸和蛋氨酸代謝、色氨酸代謝及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；與氣虛血瘀型相關的有21個，其主要代謝途徑有花生四烯酸代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸β氧化代謝和維生素B6代謝；與寒凝氣滯型相關的有23 個，其主要代謝途徑有氨酸的合成與降解、脂肪酸的代謝及甘油磷脂的代謝。

4 代謝組學在CHD 不同證型中物質基礎比較研究中的應用研究

張紅栓課題組［20-21］研究表明，痰濁證組乳酸含量較高，血瘀證組丙氨酸含量較高，痰濁證組低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂類化合物、酮體、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白、天門冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酞胺、白蛋白賴氨酰含量均高于血瘀證組，高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸、丙氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸含量均低于血瘀證組，間接說明兩組均存在能量和氨基酸代謝紊亂，且痰濁組脂代謝和糖代謝紊亂相對血瘀組較嚴重；尿液代謝物中，痰濁證組檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸、葡萄糖、3-羥基丁酸、丙酮、酪氨酸、肌酐、氧化三甲胺、二甲胺、馬尿酸的含量均高于血瘀證組，而膽汁酸、組氨酸的含量低于血瘀證組，提示血漿及尿液中發生變化的代謝物能在一定程度上作為區分CHD 心絞痛不同中醫證型的特異性生物標志物。楊小芳等［22］將60例CHD心絞痛患者分為氣滯血瘀和氣虛血瘀組，同時設置對照組30 例，利用LC-MS對血清樣本氨基酸含量進行PLS-DA分析及差異物質基礎分析發現，兩組差異主要在組氨酸和瓜氨酸的代謝通路上。朱明丹等［23］應用液相色譜串聯飛行時間質譜技術分析CHD 痰阻心脈、氣陰兩虛、氣滯血瘀患者及健康人血漿小分子代謝產物，發現氣滯血瘀證組中葡萄糖、花生四烯酸、亞油酸含量較高，苯丙氨酸、甘氨酸、高絲氨酸、葡萄糖、磷酸肌酸在氣陰兩虛證組中含量較低，葡萄糖含量痰阻心脈證組較氣滯血瘀證組高。朱萱萱等［24］分別選取CHD 痰阻心脈、氣陰兩虛、氣虛血瘀和氣滯血瘀患者作為研究對象，應用GCTOF/MS測定其血清內源性代謝物，并用PLS-DA對其代謝譜分析，結果表明，此法可有效區分疾病組和健康對照組，且可明顯區分男性患者氣虛血瘀型和痰阻心脈型，及女性患者氣虛血瘀型、痰阻心脈型和氣陰兩虛。程鵬等［25］采用GC/MS 測定CHD痰濁證和氣虛證患者血清內源性代謝物，結果顯示，痰濁證及氣虛證患者代謝物中差異最大的為絲氨酸，其次為纈氨酸、2 羥基丙酸等，比較發現痰濁證絲氨酸、2-羥基丙酸顯著高于氣虛證組，提示代謝組學可能為中醫分型提供一定參考價值。

5 代謝組學在中藥防治CHD中的應用

5.1 麝香保心丸姜鵬［26］通過反相液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜方法，采用PLS-DA 分析，對早期超急性AMI 大鼠血清進行代謝組學相關研究，篩選出14 個特征性標志物，其主要參與炎癥、心肌肥大及氧化損傷相關代謝過程，提示麝香保心丸對AMI 大鼠具有預保護作用，并可將皮質酮，醛固酮，考地松以及腎上腺素等標志物調控到正常水平從而抑制疾病發展。向麗［27］結合高效液相色譜/四極桿-飛行時間質譜檢測技術，鑒定出27個與AMI 相關的生物標志物，研究表明麝香保心丸對AMI 大鼠的治療作用主要是通過改善心肌梗死引起的能量代謝異常、氧化損傷和炎癥等途徑。

5.2 血府逐瘀膠囊/血府逐瘀湯鄭娟娟等［28］采用隨機數字表法將40例CHD心血瘀阻證患者分為治療組（西藥聯合血府逐瘀湯加減方）和對照組（西藥），基于氣相-飛行時間質譜聯用技術，運用PCA和OPLS-DA 檢測分析兩組治療前后血漿小分子代謝產物情況，結果顯示治療組治療后丙酮酸、磷酸甲酯、2-羥基戊酸、木糖醇、D-半乳糖醛酸、膽固醇的含量發生明顯變化，對照組治療前后代謝物差異無統計學意義，推斷血府逐瘀湯加減方可能通過調整糖類、脂肪、氨基酸等能量產物代謝而發揮療效。張開泰［29］指出新血府逐瘀湯可使患者血漿丙氨酸、組氨酸、乳酸、葡萄糖、極低密度脂蛋白、亮氨酸、蘇氨酸、檸檬酸的含量發生顯著變化，其可能通過調整糖類、脂肪、氨基酸等物質代謝參與疾病的治療。

5.3 復方丹參滴丸蘆勤偉等［30］使用UPLC-QTOF/MS對建立的AMI大鼠進行代謝組學研究，經分析篩選出硫酸對甲苯、馬尿酸、雌馬酚葡萄糖苷酸等8種可被復方丹參滴丸顯著調節的代謝產物，其代謝通路主要包括苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽汁酸代謝及鞘脂代謝。劉胤敏［31］通過代謝組學技術對心肌缺血大鼠進行研究，發現復方丹參滴丸干預后，大鼠血漿中延胡索酸、琥珀酸、葡萄糖、檸檬酸等9種內源性代謝物及尿液中葡萄糖、果糖、脯氨酸等9種代謝產物存在差異性變化，其主要通過調節代謝物來改善機體代謝平衡。

5.4 芪參益氣滴丸金文敏等［32］基于UPLC/MS技術，將60 只SD 大鼠隨機分為正常組、模型組和給藥組，并建立AMI 大鼠模型探討芪參益氣滴丸對AMI 大鼠的代謝學作用，結果發現芪參益氣滴丸主要通過磷脂代謝、能量代謝和脂肪酸代謝等通路調節尿苷-磷酸等9 個代謝產物的含量變化，從而發揮藥效。

5.5 通心絡膠囊張鳳霞［33］從代謝學角度出發，采用超快速液相色譜-離子阱-飛行時間串聯質譜分析技術，將動脈粥樣硬化模型大鼠的血漿和尿液作為觀察對象，采用PCA 對其代謝途徑進行分析，發現在使用中藥通心絡干預后，大鼠機體中膽汁酸代謝、溶血磷脂酰膽堿代謝和氨基酸代謝等通路呈上調趨勢。

5.6 溫心方安娜［34］基于超高效液相色譜-高分辨率質譜聯用技術，經PCA 和OPLS-DA 分析，初步鑒定出CHD心陽虛證血液中存在38個潛在生物標記物，在溫心方治療干預下，其中有16 個標志物顯著回調，其代謝通路主要是核苷酸代謝，由此也肯定了溫心方對CHD心陽虛證的確切療效。

5.7 益氣活血類方仇盛蕾等［35］通過脈沖序列實驗和LED 實驗的PLS-DA 分析結果顯示，參元益氣活血膠囊可使不穩定型心絞痛患者代謝產物指標回調至接近健康人群，可能與干預脂類代謝、糖類代謝及蛋白質代謝等通路有關。王惠等［36］對SD大鼠MI 模型進行代謝組學研究，發現益氣活血顆粒可以使MI大鼠紊亂的代謝產物含量回歸正常水平。鄭乘龍［37］從代謝學角度出發，指出益氣活血方可對MI大鼠血漿及尿液中乳酸、甘油、α葡萄糖等多種能量代謝、糖代謝和脂類代謝起到調節作用。

5.8 伏寒顆粒魏巖等［38］對CHD 先天伏寒證患者血清樣本進行1H-NMR 檢測，發現伏寒顆粒可通過對CHD 先天伏寒證患者糖脂、能量代謝調節使其代謝產物含量回歸正常范圍，達到治療目的。

6 代謝組學在針灸防治CHD中的應用

采用代謝組學有助于從新的角度揭示針灸通過臟腑-經絡學說治療CHD 的機制及規律，為針灸治療CHD 提供了堅實的科學依據和理論基礎，拓寬治療新思路。

陳亮［39］采用超快速液相-串聯質譜聯用技術，研究循經取穴、他經取穴和非經非穴對慢性穩定性心絞痛患者血漿代謝物的影響，其中循經取穴組患者治療后血漿中異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和纈氨酸呈顯著變化，他經取穴組患者治療前后代謝小分子差異無統計學意義，非經非穴組患者治療后甘氨酸呈顯著變化，結果提示循經取穴影響的代謝分子多，代謝通路廣泛，產生效果與心血管相關分子關聯度高，臨床療效也更為理想。陳美琳［40］運用電針“內關”穴預處理心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）大鼠，通過代謝組學技術觀察其干預后血清代謝物及代謝通路變化情況，發現電針“內關”可通過調節丙酮酸、氨基酸、酮體、能量等代謝產物使MIRI大鼠糖代謝、丙酮酸代謝、氨基酸代謝、酮體代謝、能量代謝等通路發生改變，達到預保護作用。

7 總結與展望

代謝組學以其獨特優勢在中醫防治CHD 方面進展突出，成效顯著，加快了中醫現代化的發展。越來越多學者［41-42］認識到從中醫角度研究代謝組學治療CHD 的重要性。隨著代謝組學技術的深入挖掘，已有研究證實此項技術對相關疾病中醫證型的分析具有關鍵指導意義，進而為中醫療效評價體系的建立提供了借鑒。但同時也存在相對不足，主要表現為以下幾個方面：1）現有的臨床研究多為橫斷面研究，缺少對動態變化過程的探討，且研究范圍多局限，難以構建較為系統的代謝物譜數據庫；2）代謝組學對代謝物的檢測不夠完全，僅能針對部分敏感代謝物顯示出特異性，分析能力和靈敏度有待提高；3）代謝組學在CHD 中醫證型、中醫療法等領域研究的經驗相對欠缺，對病理過程涉及的部分代謝通路機理尚處于探索階段，還需大量大樣本、多中心臨床及動物模型試驗加以論證；4）代謝組學對中醫防治CHD方面的研究正處于雛形階段，還未與基因組學、蛋白組學等對先天因素研究的生物學手段形成有機統一，從而未充分體現生物學系統的整體性；5）代謝組學技術檢測要求高，程序復雜，外界因素易對機體代謝組分產生影響，從而會導致檢測結果的不穩定性。

代謝組學的進步為中醫現代化發展提供了新契機，相關技術及模式識別的應用為CHD 辨證及治療提供了更為科學化、客觀化和規范化的手段和證據。以代謝組學為核心的系統生物學在中醫學領域的廣泛應用為今后臨床加強對證候本質的深入研究奠定了堅實基礎，兩者的融合與統一大大促進了中醫藥事業的繁榮發展。