上皮間質轉化介導的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥機制及中醫藥治療進展

杜怡曌,焦麗靜,許 玲,徐建芳

(1. 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437;2. 同濟大學附屬上海市肺科醫院,上海 200433)

肺癌是全世界腫瘤患者死亡的主要原因[1]。約85%的肺癌患者為非小細胞肺癌(NSCLC),其中表皮生長因子突變率為40%～80%[2]。目前表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療已成為EGFR突變的NSCLC患者的一線治療方法,但大多數患者會發生進展,這極大限制EGFR TKIs的獲益[3]。上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是一個上皮細胞通過某種特定程序轉化為具有間質表型細胞的動態過程。在此過程中,上皮細胞頂端-基底極性和完整的細胞-細胞連接喪失,同時獲得前后極性和細胞骨架的顯著重塑。其標志物表達下調,如N-Cadherin、E-Cadherin,而Vimentin、纖連蛋白等間質標志物表達上調,并且細胞具有更強的侵襲能力、治療抵抗力和癌癥干細胞樣特性[4]。近十年來相關研究指出EMT與耐藥之間存在聯系,如HCC827 細胞的吉非替尼耐藥亞系顯示出與EMT一致的表型和分子變化[5];對吉非替尼和奧希替尼各產生獲得性耐藥的NSCLC細胞HCC827和H1975沒有EGFR繼發突變,卻表現出EMT特征[6]等。中醫藥作為一種有效的輔助治療手段被多項研究證明可以通過多種途徑抑制或逆轉EMT,從而達到延緩EGFR-TKIs耐藥發生的目的,提高患者生存率。因此進一步了解EMT介導耐藥的機制基礎,深入探究傳統中醫藥與EMT現代藥理之間錯綜復雜的關聯,有助于提高NSCLC患者TKI治療的效益,可為NSCLC治療提供有前景的策略。

1 EMT在EGFR-TKIs耐藥中的作用

1.1鈣黏附蛋白E(E-cadherin) E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白,它分布于人和動物的各類上皮細胞,參與細胞間黏附,在維持細胞的極性和完整性等方面起重要的作用。E-cadherin的表達與EGFR-TKI分子靶向治療敏感性有密切關系。研究發現對EGFR-TKIs高度敏感的NSCLC細胞株Calu3會表達E-cadherin,而耐藥株H157則不表達E-cadherin[7]。加權線性加和(76-gene EMT signature)表明,EMT信號與E-cadherin蛋白水平顯著正相關;根據EMT信號分類為間充質的細胞對厄洛替尼也更具耐藥性[8]。EGFR和E-cadherin的亞細胞定位非常相似,都存在于細胞間黏附的帶狀帶中[9]。早期免疫實驗表明,在細胞黏附連接的過程中,E-cadherin與EGFR共同聚集,通過物理作用,直接協同激活下游信號通路,從而導致Shc的磷酸化和MAPK酶活性的增加。最近的研究表明,E-cadherin作為信號轉導分子,其黏附連接的組裝可以觸發上皮細胞中PI3K/Akt的激活。其介導的鈣依賴黏附連接的形成誘導EGFR的配體非依賴性激活和MAPK的激活狀態迅速增加,這一過程可以被EGFR-TKI完全抑制[7]。由此看出,E-cadherins可以通過與EGFR的結合來啟動由外向內的信號轉導通路。而有關研究觀察到上皮細胞系(EGFR突變型和野生型)相較于間充質系有明顯更廣的EGFR通路激活[8]。雖然EGFR野生型患者的激活機制尚不清楚,但上皮型NSCLC中EGFR通路激活的頻率較高可能是其對厄洛替尼更敏感的原因。此外,相關研究還報道了E-cadherin可以負調控不同類型受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)的配體依賴激活,降低受體流動性和配體結合親和力[9]。因此,間充質細胞中E-cadherin的減少可能降低了其生長對EGFR信號通路的依賴,從而降低EGFR-TKIs的敏感性。

1.2EMT相關酪氨酸激酶(RTK)軸 EMT可通過激活下游通路降低細胞對EGFR-TKIs的敏感性。AXL是Tyro3-AXL-Mer(TAM)受體RTK的成員,其高表達常與耐藥性相關,它也是NSCLC[8]中EMT基因表達特征的一部分。與EMT相關的兩個轉錄因子復合體(YAP1和TAZ)可以調控AXL的表達。在Kras驅動的小鼠肺癌模型中,YAP1被證實參與調節EMT的轉錄程序[10];在上皮細胞中,TAZ與細胞極性決定簇Scribble相互抑制,EMT通過破壞這種聯系可以激活TAZ-TEAD[11]。這兩個旁系同源蛋白與TEAD1-4轉錄因子相互作用,共同被招募到AXL基因啟動子。此外,YAP1與ZEB1物理上相互作用,可以占據AXL基因啟動子并刺激轉錄[12]。同時,AXL基因是Fos相關抗原1(Fos-related antigen1,Fra-1)[13]的直接靶點,在乳腺癌[14]的EMT過程和耐藥性中,Fra-1是調節EMT的關鍵因子。對乳腺癌細胞中YAP/TAZ-TEAD和AP-1轉錄組的全基因組分析揭示了這些復合體與驅動侵襲和生長的基因增強子存在物理聯系[15]。AXL通過多種機制激活細胞生存途徑,幫助NSCLC細胞逃避EGFR靶向治療:AXL的活化可調控 PI3K/AKT1/Rac1通路和細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)信號通路,從而促進NSCLC細胞的遷移、侵襲以及增殖,使其對EGFR-TKIs產生耐藥性[16]。AXL可引起NF-κB的早期磷酸化,并激活下游 PI3K/AKT通路,從而上調抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的表達,抑制促凋亡蛋白caspase 3的表達,從而促進細胞存活[17]。實驗數據表明,AXL的激活確實可以導致NSCLC細胞對第一代EGFR-TKI產生耐藥性。當AXL過表達或者上調其配體Gas6時,會發現AXL的激活與厄洛替尼耐藥腫瘤樣本中的EMT特征相關,AXL抑制劑可以恢復厄洛替尼耐藥細胞株和移植瘤對厄洛替尼的敏感性[18]。這些數據支持EMT可能在由AXL驅動的EGFR-TKIs獲得性耐藥的形成過程中發揮作用。另有研究表明,間質表型細胞不僅產生持續的AXL激活,還可以顯著提高對PI3K/AKT信號通路抑制劑的抵抗,引發非EGFR依賴性PI3K/Akt信號通路激活,從而導致腫瘤細胞對厄洛替尼等EGFR-TKIs治療的不敏感,再次佐證間充質細胞可能減少了對EGFR家族RTK信號和下游信號通路的依賴[8]。AXL不僅是EMT的下游效應器,它已被證明可以驅動EMT程序并維持間充質狀態。在乳腺上皮細胞中,AXL的異位表達誘導了EMT,AXL抑制劑逆轉了間充質乳腺癌細胞的表型[19]。同樣,沉默間充質亞型卵巢癌細胞中的AXL逆轉了它們的形態和上皮標志物的激活表達,表明AXL在保護癌細胞間充質狀態方面具有共同作用[20]。

1.3免疫逃逸 通過激活免疫抑制檢查點逃避免疫監測是癌癥的標志之一[21]。T淋巴細胞表面的程序性死亡受體1(PD-1)與其配體 PD-L1結合可促進腫瘤浸潤T淋巴細胞向調節性T細胞分化以及導致T細胞耗盡,促使腫瘤細胞逃避免疫系統監視和殺傷[22]。PD-L1 高表達可能是EGFR-TKIs原發性耐藥機制之一。Hsu等[23]報道發現,EGFR突變且對EGFR-TKIs原發性耐藥的NSCLC患者的PD-L1陽性率顯著高于對照組(45.5% vs 12.3%,P<0.05),而且使用EGFR-TKI治療的PD-L1陽性患者的中位生存期和無進展生存期顯著短于PD-L1陰性患者(11.2 vs 38.2 個月;2.1 vs 7.3個月,P<0.05)。其機制可能是PD-L1引起YAP1上調[24],或通過 TGF-β/Smad誘導EMT,導致NSCLC細胞對吉非替尼產生耐藥[25]。相關文獻表明,EMT可能導致腫瘤細胞的免疫逃逸,從而導致對EGFR-TKIs的耐藥性。間質評分高的肺腺癌中PD-L1基因表達明顯上調[26]。對PD-L1基因調控的分析證明,PD-L1在NSCLC細胞中是miR-200家族的直接靶點[27],在乳腺癌中受miR-200/ZEB1軸的調控[28]。因此,ZEB1在NSCLC細胞中的表達可能以PD-L1依賴的方式調節浸潤性CD8+T細胞的功能,同時增強NSCLC細胞對干擾素-γ(可驅動PD-L1)的反應[27]。除了PD-1/PD-L1通路外,在表現為EMT表型的肺腺癌中還檢測到多種靶向免疫檢查點分子的升高[26]。這些數據表明,EMT通過與PD-L1的相互作用,可能導致肺癌細胞對EGFR-TKIs的耐藥。

1.4其他 除上述機制外,EMT還可以通過激活ABC(ATP binding cassette,ATP結合盒)轉運蛋白獲得耐藥性。由于ABC轉運蛋白增加藥物外排的特性,導致細胞質內藥物密度降低,故研究發現ABCG2(ABCG亞家族成員2)轉導的細胞對吉非替尼具有耐藥性[29]。這與MiRNA的調控相關,如miR200可以直接靶向ZEB1和ZEB2的3‘-UTR區域,而在EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞系中檢測到ABC轉運蛋白ABCB1的表達增強,并表現出CSC/間充質特征和miR-200的表觀遺傳沉默[30]。此外,表觀遺傳等[31]復雜調控也是EMT導致EGFR-TKIs耐藥的原因。

2 中藥抑制EMT克服EGFR-TKIs耐藥的研究

2.1中藥單體

2.1.1紫草素 紫草素(shikonin)是從草本植物紫草中提取的一種萘醌類化合物,具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性作用[32]。路京等[33]研究發現肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)誘導人肺癌HCC827細胞發生EMT,在加入紫草素干預后,則可逆轉HCC827細胞 E-cadherin蛋白表達下調和Vimentin蛋白表達的上調,恢復HCC827細胞對吉非替尼的敏感性,提示紫草素可能通過抑制EMT逆轉了細胞對吉非替尼的耐藥。這與紫草素可抑制HGF誘導的HCC827肺癌細胞中Akt和ERK的磷酸化[34],調控PI3K/Akt和MEK/ERK信號通路,從而抑制HGF/c-Met介導的EMT相關。可見,紫草素通過參與調控EMT相關RTK軸,抑制了吉非替尼耐藥。

2.1.2氧化苦參堿 氧化苦參堿(oxymatrine)是中藥苦參重要成分之一,它可以通過影響細胞骨架結構抑制EMT 的發生。實驗觀察表明,當氧化苦參堿的劑量由0.5 mM升高為 1 mM時,非小細胞肺癌A549細胞Vimentin的結構由遍布細胞的網狀結構轉變為出現在部分細胞細胞核附近的點狀結構,伴有Vimentin熒光強度下降及E-cadherin的表達水平升高[35]。沈云飛等[36]通過苦參對人肺腺癌耐吉非替尼 PC9/ZD細胞株的逆轉研究發現,苦參聯合吉非替尼能夠明顯抑制細胞侵襲能力,并提高耐藥細胞對吉非替尼的敏感性,誘導PC9/ZD 細胞Vimentin、N-cadherin蛋白表達下調,E-cadherin表達上調,調控EMT,從而逆轉EGFR-TKIs的耐藥。由此推斷,苦參通過參與細胞骨架重建,提高E-cadherin水平,抑制EMT,從而逆轉靶向耐藥。但是該實驗中研究者選用材料為復方苦參液,其中涉及苦參的具體成分尚不明確,在此過程中是否受到其他成分影響有待進一步研究。

2.1.3重樓皂苷I 重樓(rhizoma Paridis) 是百合科重樓或七葉一枝花的根莖,主要化學成分為甾體皂苷[37]。重樓皂苷I (polyphyllin I) 可以抑制NSCLC細胞株PC9和A549 的NF-κB亞基p65蛋白磷酸化及其下游靶基因如Bcl-2的表達[38-39]。NF-κB可以與IL-6基因的啟動子相結合,與其他轉錄因子協同作用于IL-6啟動子,促進IL-6的表達[40]。這解釋了Lou等[41]通過體外實驗發現重樓皂苷I通過抑制IL-6/STAT3信號通路,逆轉厄洛替尼獲得性耐藥肺腺癌細胞株HCC827的EMT過程,有效恢復其藥物敏感性這一事實。結合以上研究,合理推斷重樓皂苷I通過抑制NF-κB途徑減少IL-6的產生,參與調控AXL與EMT的平衡,進而恢復耐藥細胞的藥物敏感性。

2.1.4黃芪多糖 黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是黃芪干燥根莖提取出的一種水溶性成分,也是中藥黃芪發揮作用的主要成分,具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤等生物學性[42]。Wei等[43]利用TGF-β1誘導肺腺癌細胞株PC9發生EMT,產生GR細胞。通過對PD-L1/SREBP-1途徑進行基因敲除,可抑制GR細胞增殖能力,同時E-cadherin表達水平增加,Vimentin表達水平降低。表明APS可以通過PD-L1/SREBP-1/EMT信號通路逆轉GR細胞的耐藥性,再次證實EMT通過與PD-L1的相互作用,可能導致肺腺癌細胞的EGFR-TKIs耐藥性。

2.1.5木犀草素 木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物,廣泛存在于夏枯草、菊花、金銀花等中藥中。實驗證明木犀草素可逆轉TGF-β1誘導的肺癌A549細胞EMT,其機制是抑制PI3K/Akt磷酸化,降低NF-κB的表達,減少與E-cadherin上游轉錄調控因子之一的Snail結合,增加E-cadherin的產生[44]。另外,王佶[45]研究發現,對于TGF-β1誘導的吉非替尼耐藥非小細胞肺癌PC-9/GR細胞,木犀草素聯合吉非替尼比單用吉非替尼對PC-9/GR細胞活力有更明顯的抑制作用,伴有E-cadherin表達上調,提示木犀草素能夠逆轉PC-9/GR細胞的EMT,進而恢復對吉非替尼的敏感性。可見,木犀草素逆轉吉非替尼耐藥與其可調控EMT-AXL軸密切相關。

2.1.6姜黃素 姜黃素(curcumin,CUR)來源于姜科姜黃屬植物姜黃,是一種多酚類活性成分,能夠阻斷上皮細胞發生EMT,對肺癌具有抗腫瘤侵襲和轉移的作用[46]。詹建偉等[47]報道HGF可誘導NSCLC 細胞PC9發生EMT,同時使c-MET/Akt/mTOR磷酸化水平增加,降低PC9細胞對吉非替尼的敏感性。單獨使用吉非替尼處理,并不能逆轉 PC9 細胞的EMT;而姜黃素與吉非替尼雙藥聯用則實現了PC9細胞E-cadherin蛋白表達上調,并阻斷HGF誘導的c-Met/AKT/m TOR磷酸化,提高PC9細胞對吉非替尼的敏感性,證實姜黃素可以通過逆轉PC9細胞EMT逆轉該細胞對吉非替尼的耐藥性。該過程可能是姜黃素通過調節c-Met/PI3K/Akt/mTOR通路,從而抑制EMT實現的[48]。

2.1.7小檗堿 鄭芳[49]針對小檗堿(berberine)聯合吉非替尼抑制NSCLC A549和H1975細胞增殖及EMT進行研究,發現小檗堿通過調控LncRNA HOTAIR/miR-34a-5p/Snai1信號通路,誘導E-cadherin蛋白表達增加,協同抑制NSCLC細胞EMT的發生,影響腫瘤細胞的侵襲和轉移,從而增加NSCLC細胞對EGFR-TKI靶向治療敏感性。其機制是小檗堿可以抑制HOTAIR表達,后者作為一種具有致癌作用的競爭性內源RNA(CERNA),通過吸附miR-34a-5p直接靶向調控EMT轉錄因子Snai1的表達,抑制EMT過程。

2.2中藥復方

2.2.1除痰解毒方 除痰解毒方是李榮亨教授40多年從大量臨床實踐中總結出來的治療肺癌的有效方劑,全方標本兼顧,具有除痰解毒抗腫瘤之功效。羅楊等[50]研究發現,除痰解毒方聯合吉非替尼對人肺腺癌耐藥細胞株H1975細胞生長的抑制作用比單用吉非替尼更明顯,同時可以不同程度地上調E-cadherin蛋白及mRNA的表達,下調Snail和Vimentin蛋白及mRNA的表達,提示除痰解毒方通過EMT途徑逆轉吉非替尼耐藥,其機制可能與增加E-cadherin的表達,避免非EGFR依賴性信號通路的激活,從而恢復肺癌細胞對EGFR-TKIs的藥物敏感性有關。

2.2.2肺巖寧方 肺巖寧方是徐振曄教授多年來治療肺癌的經驗方,具有益氣養精、散結解毒的功效,在改善患者癥狀及機體功能方面具有顯著效果。康小紅等[51]針對肺巖寧方聯合吉非替尼或厄洛替尼治療晚期肺腺癌患者(Ⅲb期或Ⅳ期)進行了回顧性分析,近期臨床療效與單純靶向治療相當,但中位疾病進展時間(TTP)明顯優于靶向治療組(12.0個月 vs 9.5個月,P=0.042)。其機制可能與肺巖寧方通過下調EMT核心轉錄因子Fibronectin和N-cadherin相關[52]。

2.2.3扶正抗癌方 扶正抗癌方是經過多年臨床實踐驗證的肺癌擬定方,具有扶正祛邪、清熱解毒、化痰祛瘀抑瘤的功效。楊小兵等[53]實驗證明扶正抗癌方可通過下調EGFR及其下游的Akt、ERK、STAT3通路逆轉A549和H1650細胞對吉非替尼的耐藥,達到抑制肺癌細胞增殖的目的。這個過程涉及扶正抗癌方可通過抑制STAT3-MMP9通路,劑量依賴性地下調N-cadherin和Vimentin蛋白的表達而逆轉EMT[54]。可見,扶正抗癌方對肺癌細胞EMT的抑制是扶正抗癌方逆轉肺癌細胞耐藥的潛在機制之一。

3 小 結

EMT是導致EGFR-TKIs獲得性耐藥的重要機制之一,已有眾多針對其開發的新藥,如IGF-1R通路調節劑AXL1717,YAP/TAZ-TEAD-AXL-GAS6 通路抑制劑、ABCG2轉運蛋白抑制劑Ko143、STAT3特異性抑制劑OPB51602等。但以上新藥大多處于Ⅰ期臨床試驗,存在半衰期較長、耐受性較差、不良反應較多等問題。

傳統醫學認為,腫瘤發生發展的關鍵在于正氣虧虛, 邪氣入侵, 痰毒凝聚, 因虛致實,治療上當遵循扶正祛邪、益氣養精、化痰散結等治則,多選用具備清熱活血、解毒散結、化痰祛濕、理氣健脾等多重功效的中藥,復方配伍也注重益氣養陰,祛邪兼顧人體正氣;清熱不離解毒,祛痰不舍化瘀。中藥配合EGFR-TKIs,可增強其療效,改善患者臨床癥狀和體征,延長生存時間,減輕毒副作用,防止腫瘤的復發和轉移,穩定腫瘤的進展,讓腫瘤和機體和平共處,實現“帶瘤生存”。因其優勢,中醫藥越來越得到世界范圍內的認可,只是目前仍存在一些未解決的問題:①某種中藥通過EMT途徑延緩靶向藥物耐藥的同時,是否還通過其他途徑聯合達到逆轉耐藥的效果?②現有許多研究發現某些中藥可以抑制或逆轉肺癌細胞EMT過程,但并未進一步求證其是否可以逆轉靶向藥物耐藥。③目前EMT通過何種分子機制參與NSCLC發生EGFR-TKIs獲得性耐藥仍不明確。④尚且缺少中藥逆轉靶向藥物耐藥的大型臨床試驗或RCT試驗,需要積累更多的臨床經驗,兼顧臨床療效、不良反應等。以上種種都可以作為日后研究及試驗的切入點,成為探討通過EMT逆轉EGFR-TKIs耐藥性的關鍵環節。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。