青梅野生酵母菌的篩選鑒定與耐受性研究

杜沁嶺，屠婷瑤，徐文，王松濤，董怡，賈冬英*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)2(瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州，646000)

青梅果含有多種有機酸、礦物質(zhì)、維生素、多酚、黃酮等物質(zhì)，具有濃郁的香氣和突出的特征風味，是釀造養(yǎng)生果酒的良好原料[1]。青梅果酒不僅具有良好的口感與獨特的風味，同時能有效保留青梅中的營養(yǎng)與活性成分[2-3]，成為亞洲地區(qū)深受歡迎的發(fā)酵酒。

酵母菌是果酒生產(chǎn)最為關(guān)鍵的因素，對其品質(zhì)至關(guān)重要。目前，國內(nèi)青梅果酒釀造主要采用葡萄酒釀造酵母，將其用于青梅發(fā)酵時不能較好地適應(yīng)青梅汁的高酸環(huán)境，導(dǎo)致青梅果酒發(fā)酵時間長、酒體單薄、風味不足、缺乏典型性[4]。因此，篩選優(yōu)良青梅果酒釀造專用酵母是提高其品質(zhì)的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外有關(guān)青梅果酒釀造專用酵母的研究較少，且大多以青梅自然發(fā)酵液或者青梅果實作為菌種分離源。趙玲燕[5]從青梅發(fā)酵液中分離出100株酵母，通過三級篩選獲得1株產(chǎn)酒精和發(fā)酵能力較好的青梅釀酒酵母；王輝等[6]從大肉青梅自然發(fā)酵液中分離出1株能耐受pH 3.0和葡萄糖質(zhì)量濃度為400 g/L且可產(chǎn)生良好香氣的酵母菌。然而，目前尚未見這些酵母菌用于青梅果酒生產(chǎn)的報道。糖漬能夠抑制青梅的雜菌生長和部分代謝酶的活性，同時還能保留青梅特有的香氣，降低有機酸含量，是制備青梅露和保留青梅風味的有效方法，也是獲取青梅野生酵母的重要途徑。本研究從糖漬青梅液和青梅果皮中分離出10株野生酵母菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和發(fā)酵特性研究篩選出6株酵母菌，采用26S rDNA序列分析對其進行鑒定，并探討了其耐受乙醇、葡萄糖和低pH的能力，以期獲得具有良好發(fā)酵性能的青梅果酒專用酵母，為優(yōu)質(zhì)青梅果酒的生產(chǎn)提供重要保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糖漬青梅液是成都大邑種植的新鮮青梅洗凈、瀝水后稱重，分別加入其質(zhì)量30%、40%、50%的白砂糖，密封后分別于室溫下放置至白砂糖完全溶解；YPD固體培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；無水葡萄糖、無水乙醇等，國產(chǎn)分析純試劑。

GHP-9080隔水式培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-6000PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；ZHWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌分離純化

將1 mL糖漬青梅液以10倍梯度稀釋法稀釋至10-3～10-7，取0.1 mL稀釋液于YPD固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后28 ℃下培養(yǎng)2 d。觀察菌落形態(tài)后挑取表面光滑濕潤、中間隆起的具有典型酵母菌形態(tài)特征的單個菌落進行平板劃線，純化培養(yǎng)2次后顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)、形狀、繁殖方式，然后進行保藏。

1.2.2 酵母菌篩選

(1)產(chǎn)氣性能測定：在含有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中加入分離出的酵母菌，分別于28 ℃下培養(yǎng)24、48 h觀察杜氏管中出現(xiàn)氣體的情況[7]。

(2)產(chǎn)乙醇、產(chǎn)香和發(fā)酵能力測定：按照2%(體積分數(shù))的接種量(菌液濃度為107CFU/mL)，將分離菌株接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖質(zhì)量濃度調(diào)整為260 g/L)，28 ℃下振蕩(100 r/min)發(fā)酵8 d，測定發(fā)酵液的酒精度[7]，評價發(fā)酵液的香氣，并參照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》測定其總酯含量[8]，相同條件下以未調(diào)整葡萄糖的YPD液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵力測定，發(fā)酵過程中每隔12 h測定1次質(zhì)量，直至第8天。以發(fā)酵時間(x，min)為橫坐標，CO2質(zhì)量損失(y，g)為縱坐標，繪制發(fā)酵力曲線[7]。

1.2.3 酵母菌分子生物學(xué)鑒定

在北京擎科生物科技有限公司完成。采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進行26S rDNA擴增并測序。將測序結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中與已知序列進行同源比對分析，并采用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 酵母菌耐受性測定

參照李亞輝等[7]的方法對篩選酵母菌的耐受性進行測定，并稍作修改。調(diào)整YPD液體培養(yǎng)基中乙醇的體積分數(shù)(4%、6%、8%、10%、12%)，葡萄糖的質(zhì)量濃度(300、350、400、450、500 g/L)和pH(2.5、2.7、2.9、3.1、3.3、3.5)，按照1.2.2(2)方式接種，于28 ℃下振蕩(150 r/min)發(fā)酵48 h，在600 nm下測定發(fā)酵液的OD值，分別以不添加乙醇、葡萄糖、乳酸的YPD培養(yǎng)基為空白對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的篩選

2.1.1 形態(tài)觀察

對分離純化后得到的酵母菌進行形態(tài)觀察和顯微鏡鏡檢后除去重復(fù)菌株，共篩選出10株酵母菌，編號為J1～J10，其菌落形態(tài)和細胞形態(tài)分別見表1和圖1。10株菌的菌落形態(tài)相似，多為疏松狀、圓形、突起、濕潤、光滑的典型酵母菌落形態(tài)，但其菌落顏色、邊緣規(guī)則程度和挑起性卻不盡相同。細胞形態(tài)均為出芽繁殖，形狀分橢圓形和圓形兩種。

表1 分離酵母菌的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)

圖1 分離酵母菌的細胞形態(tài)

2.1.2 產(chǎn)氣性能

10株菌的產(chǎn)氣能力見表2?？梢钥闯?，除J1外，發(fā)酵48 h后其余9株菌的發(fā)酵液均出現(xiàn)產(chǎn)氣，表明這些菌株生長和發(fā)酵速率快，因此選擇該9株菌進入后續(xù)的篩選實驗。

表2 酵母菌產(chǎn)氣能力

2.1.3 產(chǎn)酒能力

9株菌發(fā)酵8 d后所得發(fā)酵液的酒精度差異較大(表3)。其中，J7、J8和J9產(chǎn)乙醇能力極強，顯著高于其他6株菌(P<0.05)，其發(fā)酵液的酒精度均高于10%vol；J3、J4、J5和J10有一定的產(chǎn)乙醇能力，其發(fā)酵液的酒精度均超過4.5%vol；但J2和J6產(chǎn)乙醇能力較差，其發(fā)酵液的酒精度均低于4%vol。

表3 九株酵母菌的產(chǎn)酒與產(chǎn)香能力及其發(fā)酵液的香氣

2.1.4 產(chǎn)香能力

酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風味物質(zhì)大多以酯類形式存在。9株菌均具有一定的產(chǎn)香能力，其發(fā)酵液的總酯含量和香氣見表3。其中，J3、J5、J6和J10的產(chǎn)酯能力明顯高于其他5株菌(P<0.05)，以J5的產(chǎn)酯能力最高(2.56 g/L)，其發(fā)酵液的總酯含量均超過2 g/L，且香氣濃郁。其余5株菌的產(chǎn)酯能力較低，J7和J9發(fā)酵液的總酯含量僅為0.93 g/L和0.87 g/L，且香氣平淡。由于青梅果酒發(fā)酵菌的選育需要綜合考慮其產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力，因此淘汰產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力均差的J2和J4。將篩選后得到的7株菌分為兩大類，即產(chǎn)乙醇能力強菌株(J7、J8、J9)和產(chǎn)酯能力強菌株(J3、J5、J6、J10)，分別測定其發(fā)酵力。

2.1.5 發(fā)酵力

酵母菌可利用糖進行發(fā)酵，并產(chǎn)生大量的CO2和乙醇，故CO2質(zhì)量損失的多少可用于判斷菌株發(fā)酵能力的強弱[9]。產(chǎn)乙醇能力強菌株的發(fā)酵力如圖2所示。在發(fā)酵前36 h，J7、J8、J9發(fā)酵液的CO2產(chǎn)生量均隨發(fā)酵時間延長而增加，第36 h時達到最大，CO2質(zhì)量損失分別為3.52、3.21、3.49 g，說明此時菌株處于對數(shù)生長期，開始大量繁殖；36 h后隨著發(fā)酵時間的延長，CO2產(chǎn)生量逐漸下降；第132 h時，3株菌發(fā)酵力基本相當，CO2幾乎無質(zhì)量損失，表明132 h后所有菌株已完成發(fā)酵。

圖2 產(chǎn)乙醇能力強菌株的發(fā)酵力

產(chǎn)酯能力強菌株的發(fā)酵力如圖3所示。在發(fā)酵前24 h，J3、J5、J6、J10發(fā)酵液的CO2產(chǎn)生量均隨發(fā)酵時間的延長而增加，第24 h時達到最大，CO2質(zhì)量損失分別為1.21、0.97、1.18、1.16 g，表明此時菌株進入發(fā)酵旺盛期；24 h后隨著發(fā)酵時間的延長，CO2產(chǎn)生量逐漸下降，第180 h時，4株菌發(fā)酵力基本相當，CO2幾乎無質(zhì)量損失，說明180 h后所有菌株已完成發(fā)酵。該4株菌的起酵時間較上述3株產(chǎn)乙醇菌提前了12 h，且CO2產(chǎn)生量普遍較低，這可能是產(chǎn)酯菌與產(chǎn)乙醇菌隸屬于不同酵母菌種，具有不同的適宜生長條件、代謝特點和發(fā)酵能力[10]。產(chǎn)乙醇菌的生長能力更強，對發(fā)酵底物利用更充分，能夠釋放出更多的CO2。可利用此特性將該2種不同類型酵母菌分別接種進行青梅果酒發(fā)酵。綜合以上結(jié)果，淘汰發(fā)酵力較弱的J5(CO2質(zhì)量損失<1 g)，選擇其余6株菌進行后續(xù)的分子生物學(xué)鑒定和耐受性實驗。

圖3 產(chǎn)酯能力強菌株的發(fā)酵力

2.2 篩選菌株的鑒定

對6株菌DNA分別進行提取和PCR擴增后得到其電泳圖(圖4)。全部菌株的DNA片段長度在500～750 bp左右，其基因序列長度符合酵母菌理論預(yù)期[11]。用MEGA軟件處理同源菌株基因得到6株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。J7、J8和J9與釀酒酵母的同源性較高，J3、J6和J10與葡萄汁有孢漢遜酵母同源性較高。因此，確定前3株菌為釀酒酵母，后3株菌為葡萄汁有孢漢遜酵母。

圖4 酵母菌 PCR擴增電泳圖

圖5 六株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 酵母菌的耐受性

2.3.1 乙醇耐受性

高濃度乙醇可抑制酵母菌細胞的生長和活力，影響其發(fā)酵效果[12]。6株酵母菌的乙醇耐受性見表4。隨著乙醇體積分數(shù)增加，6株菌的耐受能力逐漸減弱，且3株釀酒酵母對乙醇的耐受能力明顯強于3株葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)，以J7和J8的耐受性最強，它們在10%乙醇中仍可生長旺盛。耐乙醇能力強的菌株可使發(fā)酵更完全，從而提高發(fā)酵酒的酒精度[13]。雖然3株釀酒酵母在高于10%乙醇中耐受能力減弱，但在YPD培養(yǎng)基發(fā)酵中產(chǎn)生酒精度超過10%vol，說明其適應(yīng)性馴化能力較強，這種類型酵母可通過采用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式提高其乙醇耐受性[14]。葡萄汁有孢漢遜酵母的生長受到高體積分數(shù)乙醇的顯著抑制，J3、J6和J10分別在8%、6%和8%乙醇條件下生長受到抑制。隨著發(fā)酵的進行，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和乙醇含量增加對非釀酒酵母生長的抑制作用更加明顯，這與馮文倩等[15]關(guān)于葡萄汁有孢漢遜酵母對乙醇的耐受結(jié)果相似。本研究中篩選出的6株菌對乙醇的耐受能力高于從青梅自然發(fā)酵液中篩選得到的酵母菌[6]。

表4 六株酵母菌的乙醇耐受性

2.3.2 葡萄糖耐受性

葡萄糖是酵母菌發(fā)酵的動力能源，但其濃度過高則會抑制酵母菌的生長，優(yōu)良酵母菌株應(yīng)具備較高的葡萄糖耐受能力[16]。6株酵母菌的葡萄糖耐受性見表5。6株菌均能耐受400 g/L葡萄糖，且3株釀酒酵母在<400 g/L葡萄糖中的生長能力明顯強于3株葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)，以J7的耐受能力最強。這是因為釀酒酵母細胞能充分利用葡萄糖進行生長繁殖，產(chǎn)生更多的乙醇[17]。釀酒酵母J7、J8和J9對葡萄糖的耐受能力隨其質(zhì)量濃度的增加先增大后減弱，在初始葡萄糖為300 g/L時耐受性最強；產(chǎn)酯酵母J3、J6和J10對葡萄糖的耐受能力隨其質(zhì)量濃度的增加持續(xù)減弱。造成該兩種類型酵母對葡萄糖耐受能力變化趨勢不同的原因在于外部環(huán)境的滲透壓對兩種酵母細胞代謝酶活性抑制的臨界條件不同[18]。然而，當初始葡萄糖為450 g/L時，3株釀酒酵母均表現(xiàn)出明顯的生長抑制，其生長能力顯著低于葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)。這可能是因為釀酒酵母在高糖條件下發(fā)酵更加徹底，將糖分轉(zhuǎn)化為更多的酒精，從而抑制其生長。當初始葡萄糖為500 g/L時，6株菌均不具備生長能力。

表5 六株酵母菌的葡萄糖耐受性

2.3.3 低pH耐受性

酸脅迫是果酒發(fā)酵過程中最常見的不利條件之一。一般情況下，釀酒酵母最適生長pH為3.8～6.0，極少數(shù)用于果酒發(fā)酵的酵母菌可能具有耐受pH 3.2的環(huán)境條件[19-20]。因此，篩選可耐受低pH環(huán)境的酵母菌是青梅果酒釀造的關(guān)鍵[2]。6株菌的低pH耐受性見表6。在pH為3.3～3.5時，6株菌均能正常生長(OD600<2.0)，但其耐受能力有所差異。其中，J3、J7、J9和J10耐受能力明顯高于J6和J8(P<0.05)，以J7耐受能力最強；當pH<3.3時，6株菌的耐受能力均隨著pH降低逐漸減弱；當pH為2.9時，J3、J6、J7、J8和J9仍可正常生長，以J9和J6的生長最為旺盛，但J10表現(xiàn)出明顯的生長抑制(P<0.05，0.5

表6 六株酵母菌的低pH耐受性

3 結(jié)論

本研究從糖漬青梅液和新鮮青梅果皮中分離出青梅野生酵母菌，并探討了其發(fā)酵特性。通過菌落形態(tài)和細胞形態(tài)觀察篩選出10株不同形態(tài)的酵母菌，編號為J1～J10；通過比較菌株的產(chǎn)氣、產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力及發(fā)酵力獲得6株具備優(yōu)良性能的酵母菌，分別為J3、J6、J7、J8、J9、J10；26S rDNA測序鑒定為釀酒酵母(J7、J8、J9)和葡萄汁有孢漢遜酵母(J3、J6、J10)。6株酵母菌具備較好的耐受能力，能耐受4%(體積分數(shù))、400 g/L葡萄糖和pH 3.1的環(huán)境條件，且釀酒酵母對乙醇的耐受能力強于葡萄汁有孢漢遜菌，但其對葡萄糖耐受能力低于后者。整體而言，本研究篩選獲得的6株酵母菌具備良好的發(fā)酵性能和較好的生長特性與耐受能力，經(jīng)過馴化后有望成為優(yōu)質(zhì)青梅果酒釀造菌種。