卵孢小奧德蘑菌株的拮抗及ISSR遺傳分析

連燕萍 趙光輝 吳振強 袁濱 柯麗娜 張志鴻

（1. 漳州市農業科學研究所 福建漳州 363005；2. 福州市農業科學研究所 福建福州 350014）

卵孢小奧德蘑 [Oudemansiella raphanipes(Berk.) Pegler & T.W.K.Young]，也叫卵孢長根菇，商品名為黑皮雞樅，隸屬于真菌界（Fungi）、擔子菌門（Basidiomycetes）、傘菌綱 （Agaricomy cetes）、蘑菇目（Agaricales）、膨瑚菌科（Physalacri ceae）、小奧德蘑屬（Oudemansiella）[1]。一直以來，學者們對長根菇的分類分歧較大，曾將其命名為長根小奧德蘑（O.radicata）[2]。直到2015年，郝艷佳等[3]通過形態學和分子生物學相結合的方法，對長根菇進行了系統的研究，最終將其定為卵孢小奧德蘑（Oudemansiella raphanipes）。卵孢小奧德蘑在我國大部分地區以及國外都有分布，是一種偏高溫結實性的木腐菌，其子實體呈黑褐色，菌肉細嫩爽口，味道極鮮[4]，當前零售價較高，一般在 30~60元/kg。卵孢小奧德蘑子實體中蛋白含量很高，鮮味氨基酸的含量特別高[5]，子實體和菌絲發酵液中含有多種藥用成分，其中長根菇素有降壓功效，長根菇多糖有抗氧化和消炎護肝等作用，具有極高的藥用價值，是一種極具應用價值的珍稀食用菌[6]。目前卵孢小奧德蘑在我國多個省市地區均有種植。由于卵孢小奧德蘑在我國的栽培歷史短，從20世紀80年代初期至今僅有30年左右的時間，研究重點主要在菌絲培養、栽培技術和生物學特性等方面[7-8]，在卵孢小奧德蘑菌株的親緣關系分析鑒定方面的報道極少，采用拮抗試驗和ISSR-PCR標記分析相結合的方法對卵孢小奧德蘑菌株進行分析鑒定更為少見。隨著卵孢小奧德蘑種植范圍的擴大、種植面積的增大，在生產及試驗過程中菌種混雜、種源不清楚、同名異株、同株異名的問題漸漸出現，而且品種退化較嚴重，優質菌種利用率低，嚴重制約了產業的發展。因此，本研究收集了15個來自國內不同地區的卵孢小奧德蘑菌株，通過拮抗試驗和ISSR-PCR標記分析對收集到的菌株進行分類鑒定及遺傳多樣性分析，以期明確卵孢小奧德蘑菌株的親緣關系，為卵孢小奧德蘑種質資源保護、良種選育、雜交育種提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材供試材料為15個卵孢小奧德蘑菌株，具體信息如下（表1）。

表1 供試的卵孢小奧德蘑菌株

1.1.2 試劑及引物Taq DNA聚合酶、dNTP、引物均購自上海生物工程技術服務有限公司，其他試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.1.3 培養基PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 拮抗試驗將供試菌株進行擴繁培養，取菌齡相同的菌株進行試驗，按品字形將3個不同菌株接種到同一平板中[9]，置于25℃恒溫培養箱培養，待菌絲長滿后，觀察不同菌株間的拮抗反應情況。試驗設置3個重復。

1.2.2 供試菌株DNA提取基因組DNA采用試劑盒法進行提取。

1.2.3ISSR-PCR分析ISSR引物篩選：選取能夠擴增出穩定特異條帶的20條引物，對供試菌株進行擴增（表2）。

表2 供試菌株鑒定所用ISSR引物

ISSR-PCR擴增體系：在25 μL反應體系中，引物1 μL、dNTPs 2 μL、Taq酶0.3 μL、Buffer緩沖液2.5 μL、模板DNA1 μL、ddH2O 18.2 μL。

ISSR-PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，44~52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸 10 min。

ISSR-PCR擴增產物檢測：1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL GoldviewTMDNA染料）電泳檢測。

1.2.4 數據分析供試菌株的拮抗試驗結果以NY/T 1845—2010為鑒定方法進行判斷。

ISSR分析是通過對擴增產物的分析，將出現的穩定性條帶記為1，無條帶記為0，得到矩陣表，通過公式算出多態位點百分率P[10]。通過NTSYS-pc 2.0軟件進行聚類分析，得出遺傳聚類分析圖。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的拮抗反應分析

拮抗反應分析是初步鑒定菌株差異的方法。若菌絲長滿后，菌株之間的菌絲無明顯差異、菌落交界處能融合，可初步鑒定為無拮抗反應；若菌絲長滿后，菌絲接觸區出現隔離拮抗線、溝壑狀、菌絲隆起或者產生色素帶等，則初步鑒定為有拮抗反應。如圖1所示，菌株2與菌株5、11之間的拮抗反應明顯，表現為溝壑狀，菌株5與菌株11的拮抗反應表現為不明顯的拮抗線，菌株5、6、8之間沒有拮抗反應。供試的15個菌株之間的拮抗反應結果具有一定的差異，拮抗反應結果見表3。從表3可以看出，有44組產生拮抗反應，61組沒有產生拮抗反應，其中菌株1與菌株2、3、14有明顯的拮抗線，菌株2、3、14 與其他菌株之間的拮抗線也非常明顯，均呈現為溝壑狀拮抗線。其他菌株之間的拮抗反應不明顯，大部分菌株在平板上沒有拮抗反應。

圖1 供試菌株拮抗圖

表3 供試菌株間的拮抗反應情況

2.2 供試菌株的遺傳相似系數分析

遺傳相似系數通常用來度量群體或個體間的相似程度。樣本的遺傳關系越近，遺傳相似系數越大，反之相似系數越小[11]。試驗結果表明，15個供試菌株的遺傳相似系數在0.420~0.885，平均值為0.628；其中菌株2和菌株3遺傳相似系數最大，表明這2個菌株在這15個引進菌株群體中的親緣關系最近；而菌株6與菌株14遺傳相似系數最小，表明這2個菌株的親緣最遠。菌株2、3，菌株4、9，菌株7、8，菌株9、13，菌株11、12，菌株13、15之間的遺傳相似系數均≥0.75，遠大于平均值，表明這幾個菌株間的親緣關系相對較近；從遺傳相似矩陣數值（表4）分布可以看出，遺傳相似系數≥0.8占比2.9%，遺傳相似系數≤0.5占比3.8%，遺傳相似系數為0.7~0.79、0.60~0.69、0.50~0.59占比分別為19.1%、41%、33.3%，表明這15個菌株間具有一定的遺傳多樣性和較高的遺傳豐富度。

表4 相似性矩陣表

2.3 供試菌株的ISSR多態性分析

試驗選取能夠擴增出穩定特異條帶的20條引物對卵孢小奧德蘑菌株進行ISSR擴增，分別為807、811、815、834、840、841、842、844、853、854、864、876、884、885、886、887、888、889、895、899。這20條引物對卵孢小奧德蘑菌株均能擴增出穩定條帶，多態性條帶在11~24條，共擴增出357條穩定性條帶，其中多態性條帶達329條，多態性比率為92.16%。圖2為引物864、884、899擴增供試菌株的指紋圖譜。

圖2 引物864、884、899對卵孢小奧德蘑菌株擴增的ISSR指紋圖譜

2.4 供試菌株DNA擴增圖譜聚類分析

卵孢小奧德蘑菌株DNA擴增圖譜聚類見圖3。從圖3可以看出，15個卵孢小奧德蘑菌株在相似性系數約為0.72水平時，可聚成7個類群：第1個類群為菌株1（山雞樅）；第2個類群為菌株4（天華雞樅）、9（南昌雞樅）、13（南靖雞樅2）、15（武漢雞樅2）；第3個類群為菌株5（建木雞樅）、7（Q002）、8（南靖雞樅1）；第4個類群為菌株10（S雞樅）、11（中樅）、12（HP）；第5個類群為菌株6（所雞樅）；第6個類群為菌株2（分雞樅）、3（四川雞樅）；第7個類群為菌株14（武漢雞樅1）。

圖3 卵孢小奧德蘑菌株ISSR多態性的聚類圖

供試菌株之間的遺傳相似系數在0.56~1.00，說明這15個菌株的遺傳相似性較高，基因來源較窄，其中菌株2、3的相似系數最高，為0.89，說明這2個菌株的親緣關系比較近。菌株9、13的相似系數達0.81，說明這2個菌株的親緣關系較近，但有一定的差異性，同時這2個菌株與菌株4的相似系數約為0.785，與同一類群的菌株15的相似系數約為0.725。第3類群的菌株7、8相似系數為0.77，與同類群的菌株5的相似系數約為0.735。第4類群的菌株10、11的相似系數約為0.79，與同一類群的菌株12相似系數約為0.74。菌株2、3和菌株14的相似系數約為0.61。第6類群的菌株2、3與第7類群的菌株14組成分支，與其他類群組成的分支的相似系數最小僅為0.56。

3 討論

人們最早通過菌落生長特征、子實體形態特征的不同來鑒別不同食用菌菌株，但由于所需周期長、易受環境和主觀因素的影響，難以鑒別形態差異不明顯的菌株[12-13]。拮抗試驗是在生理水平上的體細胞不親和性試驗[14-15]，具有簡單、快速、直觀等特點，食用菌普遍存在體細胞不親和性現象，因此拮抗試驗常用來初步鑒定不同菌株間的遺傳差異[16-17]。研究表明，拮抗試驗中對峙培養的菌株在菌落交界處的菌絲可分為隔離型、隆起型、色線型、溝壑型4種[18]。在本試驗中，通過拮抗試驗，供試的15個菌株中，菌株2、3、14與其他菌株之間有明顯的拮抗反應，均呈現為溝壑型，初步說明菌株2、3、14與其他菌株的親緣關系比較遠。其他菌株之間的拮抗反應不明顯，甚至沒有拮抗線，初步說明這些菌株的親緣關系比較近。

ISSR技術（Inter Simple Sequence Repeats）因具有穩定性強、多態性好、嚴謹度高、重復性好、高效快速等特點，目前被廣泛應用于食用菌種質資源鑒定及遺傳多樣性分析等方面[19]。張介馳等[13]利用ISSR分子標記，快速準確地將黑木耳生產菌株有效地區分開。宋小亞等[20]通過ISSR標記對黑木耳單核體菌株進行遺傳分析，發現各個擔孢子充分雜交或與某一親本相類似，從而反映出不同單核體菌株之間的遺傳變異。賈定洪等[21]利用拮抗與ISSR方法對香菇菌株進行鑒定，結果表明，ISSR技術能夠清晰區分2個菌株并量化出2個菌株間的遺傳差異。馮偉林等[22]利用ISSR技術篩選的11個引物對12個杏鮑菇菌株基因組進行PCR擴增并構建指紋圖譜，發現ISSR技術能夠將杏鮑菇菌株聚為3個群，清晰地揭示出了12個杏鮑菇菌株間的遺傳關系。本試驗利用篩選到的20條引物對15個卵孢小奧德蘑菌株進行PCR擴增，ISSR分析結果顯示，DNA指紋圖譜多態性較高。結合相似性系數矩陣表，在相似性系數約為0.72水平時，將供試菌株分成7個類群，表明這15個卵孢小奧德蘑菌株具有一定的遺傳多樣性與差異。

前人研究顯示，雙孢蘑菇[11]、香菇[21]、杏鮑菇[22]、白靈菇[23]、靈芝[24]、真姬菇[25]、姬松茸[26]等拮抗反應結果與ISSR分析或其他分子鑒定方法的分類結果相吻合，但也有少部分拮抗試驗結果與聚類分析存在差異。楊和川等[27]研究發現，拮抗試驗不能完全準確鑒定金針菇菌株的遺傳差異。趙淑英等[28]發現，金針菇菌株的拮抗試驗結果與聚類分析結果有一定的差異。袁濱等[29]利用拮抗反應結合ISSR-PCR鑒定11個灰樹花菌株，拮抗反應與ISSR分析結果存在差異。本研究通過拮抗反應試驗與ISSR分析鑒定15個卵孢小奧德蘑菌株，菌株2、3和菌株14與其他菌株之間的拮抗反應強烈，菌株2、3和菌株14在聚類圖中分別單獨聚成一類，這表明，拮抗反應與ISSR分析鑒定具有一定的一致性。同樣條件下，菌株1、6也分別單獨聚成一類，且與其他菌株之間的相似系數均比較低，但拮抗試驗表明，菌株1、6與大部分菌株均沒有明顯拮抗現象。拮抗結果中有44組產生拮抗反應，61組沒有產生拮抗反應，沒有拮抗反應的組別較多，但是在聚類分析中菌株之間的相似系數均比較低，這說明拮抗結果與ISSR分析結果存在一定的差異，可能原因是拮抗試驗與菌種繼代培養次數或者培養基有一定關系，這也說明拮抗試驗只能為初步鑒定菌株提供參考，最終應結合分子標記技術等多種鑒定方法進行綜合分析評價。本試驗結果表明，供試的15個菌株的來源地與聚類分析結果相關性不明顯，出現不同地區來源的菌株聚為一類，說明這15個菌株的遺傳基礎相對集中，也可能在栽培與品種選育的過程中，出現了不同地區之間相互引種或菌株分離、親本雜交的現象。

本研究采用拮抗試驗與ISSR分子標記相結合的方法來分析15個卵孢小奧德蘑菌株的遺傳多樣性，結果表明，15個菌株具有一定的遺傳差異與多樣性，其中菌株2、3關系較近且聚成一類，菌株1、6、14均單獨聚成一類，說明與其他菌株有較大差異，可作為品種選育的親本菌株。前人研究結果表明，利用多種分子標記分析比單獨使用一種分子標記鑒定的結果更準確[30]。因此，后續可以考慮結合多種分子標記技術進行驗證，為卵孢小奧德蘑菌株新品種選育和雜交育種提供依據。