海南不同地區紅火蟻社會型鑒定

楊復香 劉錦龍 張國慶 周愛明 李磊

（1. 華中農業大學植物科學技術學院 湖北武漢 430070；2. 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 海南海口 571101）

入侵紅火蟻（Solenopsis invictaBuren）是一種膜翅目（Hymenoptera），蟻科（Formicidae）的土棲性昆蟲，其食性雜，攻擊力強，種間競爭優勢明顯，具有較強的溫度適應能力、傳播和擴散能力[1-3]，是全球最具危險性的入侵生物之一。紅火蟻原分布于南美洲[4]，2003年在中國臺灣桃園、臺北縣發現有紅火蟻危害；2004年底，在中國廣東吳川首次發現紅火蟻入侵[5]；2012年在海口和文昌發現紅火蟻入侵[6]；至2018年6月，紅火蟻在我國已擴散入侵至11省317縣，且擴散傳播速度及面積有進一步增大趨勢[7]，對我國的農業生產，人類生活、身體健康及入侵地區的生物多樣性有重大威脅。

紅火蟻是社會性昆蟲，其種群具有單蟻后型和多蟻后型2種形態，前者巢穴只有一只可繁殖蟻后，而后者巢穴存在多只可繁殖蟻后[8]。除此之外，2種不同形態的紅火蟻種群在蟻巢建巢與分巢方式、蟻巢規模大小、巢穴密度、蟻群結構、種群擴散、蟻后繁殖力、工蟻大小及攻擊性強弱和同巢工蟻的遺傳相關性等方面均存在一定的差異[9-11]。

紅火蟻社會型的產生與基因型有較大關系。Ross等[12]研究發現，蟻群中蟻后的數量與Pgm-3和Gp-9基因的變異有關，而Gp-9表現出比Pgm-3更強的等位基因頻率差異，是預測多蟻后型較好的指標[13]；對Gp-9基因進行測序分析發現，其編碼一種參與種間化學識別的信息素結合蛋白，這種遺傳因素影響蟻后的生殖表型和行為策略，并決定著工蟻是否容納蟻后。單蟻后型蟻巢工蟻Gp-9基因只攜帶B等位基因，為純合子；而多蟻后型蟻巢的工蟻Gp-9處則攜帶B和b兩個等位基因，為雜合子。Gp-9Bb基因型蟻后與Gp-9BB基因型蟻后釋放不同的化學信息物質，Gp-9Bb基因型工蟻通過對化學信息素的識別，容納能夠產生相同化學信號的Gp-9Bb基因型蟻后，而排斥Gp-9BB基因型蟻后[14]。

紅火蟻社會型鑒定已有較全面的研究，具體鑒定方法有生物學觀察法[15]、蛋白質電泳法[16]、探針法[17]、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，特異性限制性片段長度多態性分析）法[18]和基于PCR技術的分子手段[19-20]等。其中基于PCR技術的分子鑒定方法簡單易行、耗時短且成功率高，僅需提取不同巢穴中工蟻的DNA，在幾個小時之內即能完成多個巢穴的鑒定[8]。本研究以采自海南7個不同地方的紅火蟻為實驗對象，基于PCR技術的分子手段對不同蟻巢的紅火蟻Gp-9基因進行擴增并鑒定，以期明確海南不同地區紅火蟻蟻巢的社會型，為其防治與監控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用紅火蟻工蟻采自海南萬寧、瓊海、海口、陵水、文昌、屯昌和儋州7個地方的不同蟻巢。采集后的工蟻用95%的酒精保存在?80℃冰箱中用于后續鑒定。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取將保存在95%酒精中的紅火蟻取出，每巢取15頭工蟻，用蒸餾水漂洗后，用TIANGEN? TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒進行DNA提取，操作步驟嚴格按照說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA產物純度，紫外分光光度計（Bio Photometerplus, Eppendorf, 德國）檢測其濃度，確保DNA的OD260/OD280和OD260/OD230均在1.8~2.0。檢測完后將DNA產物保存于?20℃。

1.2.2 PCR擴增引物合成參照Valles等[21]和文獻[8]，Gp-9B的特異性引物：26BS，5’ CTCGCCGATTCTAACGAAGGA；16BAS，5’ ATGTATACTTTAAAGCATTCCTAATATTTTGTC。Gp-9b的特異性引物：24bS，5’ TGGAGCTGATTATGATGAAGAGAAAATA；25bAS，5’GCTGTTTTTAATTGCATTTCTTATGCAG。Insert5_F1：5’ CGGAGTGCGTACGTGATCT；Insert5_R1_bSpec：5’ CCATGATCGAAAAACCGACT。引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

多重PCR擴增與Gp-9b等位基因擴增反應體系均為50 μL，包括2×PCR Mix 25 μL，4種引物各2 μL，基因組DNA 50~500 ng，用ddH2O補足至50 μL。反應程序為：98℃預變性2 min，35個循環[98℃變性10 s，55℃（Gp-9b等位基因擴增的退火溫度為47℃）退火15 s，72℃延伸30 s]，72℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

2 結果與分析

以紅火蟻工蟻DNA為模板，利用Gp-9B（26BS，16BAS）和Gp-9b（24bS，25bAS）兩對特異性引物進行多重PCR擴增。結果顯示，2種社會型的基因型是不同的。多蟻后型蟻巢的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，在423和517 bp處各有一條擴增條帶，而單蟻后型蟻巢僅在517 bp處有單一條帶。Gp-9b等位基因擴增法用Insert5_ F1和Insert5_R1_bSpec一對特異性引物進行擴增，多蟻后型蟻巢應在259 bp處有單條擴增條帶，而單蟻后型蟻巢無條帶。

用上述2種方法對在海南7個地區采集的32個蟻巢進行鑒定，多重PCR結果顯示，32個蟻巢在500 bp上下各有一條擴增條帶（圖1）。Gp-9b等位基因擴增結果顯示，32個蟻巢均在250 bp左右有單一的擴增條帶（圖2）。以上2種方法鑒定結果表明，海南7個不同地區采集的32個蟻巢均為多蟻后型蟻巢。

圖1 利用多重PCR檢測紅火蟻的社會型

圖2 利用Gp-9b等位基因擴增法檢測紅火蟻的社會型

3 討論與結論

不同社會型的紅火蟻在蟻巢密度、種群擴散速度等方面的差異與其防治密切相關。研究表明，紅火蟻蟻巢密度及分布決定防治方案的制定[22]；蟻巢密度越大，同一劑量茚蟲威餌劑對蟻巢防治效果越差[23]；此外，對紅火蟻種群擴散速度進行監測能提高防治的有效性[24]。因此，快速鑒定紅火蟻社會型對于紅火蟻的科學監測及準確防控具有重大指導意義。

Nonacs等[25]認為，紅火蟻新入侵一個地區時，棲息地廣泛存在且符合單蟻后型繁殖行為策略，而多蟻后型的出現是由于入侵地區適宜筑巢地逐漸飽和。隨后的研究表明，Gp-9BB型蟻后只能依靠自身婚飛前儲存的能量養育第一代工蟻，而Gp-9Bb型蟻后則可以通過加入已存在的多蟻后型種群共同養育第一代[26]，且不同社會型的工蟻Gp-9基因型的差異導致其識別蟻后及調節蟻后數量的能力不同。在這種簡單的遺傳控制下，紅火蟻表現出基本的社會多型性，因此具有主效作用的Gp-9單基因可以作為紅火蟻社會進化中重要復雜行為表達的基礎[14]。

利用多重PCR與Gp-9b等位基因擴增法快速鑒定紅火蟻社會型的方法已被廣泛研究報道并應用，且鑒定結果較為準確可靠[8,11]。Mescher等[27]利用Gp-9b等位基因擴增法發現，南美本土的單蟻后型蟻巢占比高于多蟻后型蟻巢；Kjeldgaard等[28]鑒定了美國德克薩斯州6個紅火蟻發生地的73個蟻巢，發現單蟻后與多蟻后型蟻巢數量比接近1∶1。本實驗結果表明，海南萬寧、瓊海、海口、陵水、文昌、屯昌和儋州7個地區的32個蟻巢均為多蟻后型。羅禮智[29]根據蟻巢密度及工蟻大小等推斷我國的紅火蟻主要為多蟻后型；邵敬國等[11]對廣東、廣西、福建和湖南4個省（區）120個蟻巢進行社會型鑒定發現，多蟻后型與單蟻后型比例約為4:1。結合前人研究與本實驗結果，可以推測在海南省紅火蟻中多蟻后型蟻巢可能占主導地位，這與我國的紅火蟻以多蟻后型為主的觀點相符。但本研究中紅火蟻的采樣只涉及海南7個地區，并未覆蓋全海南，采集的蟻巢數量有限。因此，明確海南地區紅火蟻多蟻后型與單蟻后型蟻巢的比例及分布，還需要進一步的大范圍采樣及鑒定。