膠體金免疫層析卡優化及其與ELISA法檢測克倫特羅殘留的比較

劉穎沙 劉昭彤 邢維維 魯瑤 岳彩洋 楊洋

（1. 楊凌職業技術學院生物工程分院 陜西楊凌 712100；2. 中國空間技術研究院西安分院陜西西安 710100；3. 北京維德維康生物技術有限公司 北京 100095）

克倫特羅（瘦肉精，CL）是用來促進動物生長、降低肥肉率的一種人工合成腎上腺素受體，其在組織內會有殘留，消費者食用后會危害身體健康。中國自2001年開始嚴禁銷售含有瘦肉精的肉類及配合飼料。然而，近些年，豬肉瘦肉精中毒事件屢屢皆是，2021年“3·15”新聞播出，如今，豬肉中的瘦肉精還沒有完全解決，又被發現在羊肉中添加，使消費者對肉制品出現恐慌心理[1-3]。

克倫特羅性質穩定、半衰期長，很容易在動物體內造成積累，人一旦食用殘留過多鹽酸克倫特羅的動物制品，就會造成食物中毒，嚴重者甚至死亡，世界各國已紛紛禁止將CL用作獸用飼料添加劑。但目前仍有許多不法分子違規使用，這對食品安全造成了重大隱患。因此，為確保食品安全，維護消費者的健康，急需建立快速、可靠的克倫特羅檢測方法。

對于克倫特羅的檢測方法常見的有肉眼觀察法、化學分析法、酶聯免疫法、色譜分析技術，隨著消費者對肉制品品質要求的提高，以及現有檢測實驗室、人員的不足，快速檢測法更加適用，對克倫特羅的現場檢測法最常見的是膠體金快速檢測試劑條，操作檢測只需15 min即可完成，方便攜帶，容易判定，適合屠宰場、產品驗收場等現場初篩檢測。但是市售的檢測卡靈敏度和準確度不一，大都是5 μg/L左右，容易出現假陽性或假陰性、結果不準確的現象，造成誤判[4-6]。膠體金免疫層析法與酶聯免疫法檢測克倫特羅的對比研究大部分為豬尿樣品的檢測[7-8]，現有研究報道，對膠體金標記條件的研究較多，而對于樣品墊、吸水紙優化的較少。因此，本研究優化克倫特羅單抗的制備方法，并對標記的pH、抗體標記量、離心力進行優化，確定最優標記條件，對樣品墊、吸水紙、NC膜進行探索與優化，對比在豬肉樣品檢測中膠體金免疫層析法與酶聯免疫法檢測克倫特羅的優劣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材豬肉樣品為市售。

1.1.2 試劑鹽酸克倫特羅[瘦肉精（98.8%）]、沙丁胺醇標準品、妥布特羅標準品、萊克多巴胺標準品購自于壇墨質檢-國家標準物質中心；制備膠體金免疫層析卡的原材料，例如吸水紙、NC膜、金標墊、樣品墊購自于上海捷寧有限公司；其他試劑購自于西安企鵝試劑有限公司。

1.1.3 儀器劃膜噴金儀購自于上海捷寧有限公司；可編程切條機購自于上海捷寧有限公司；酶標儀購自于美國伯樂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 克倫特羅單抗的制備以及效價檢測按照張玲玲等[9]方法采用鹽酸克倫特羅做為半抗原與載體蛋白（HSA、BSA、OVA等）偶聯制備人工抗原，進行動物免疫和單克隆抗體的制備。

1.2.2 標記條件確定（1）pH條件確定 將1.0 mL膠體金溶液加入1.5 mL的離心管中，調整pH依次為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，分別加入5 μL的克倫特羅單克隆抗體，5 min后，加入BSA溶液20 μL，放置片刻后，進行離心，棄上清液，加入200 μL復溶液重懸，通過試紙條上T線的顯色程度確定最佳pH。

（2）抗體標記量條件確定 將1.0 mL膠體金溶液加入1.5 mL的離心管中，將pH調節至7.5，分別加入1、3、5、10、20、40 μL的克倫特羅單克隆抗體，5 min后，加入BSA溶液20 μL，放置片刻后，進行離心，棄上清液，加入200 μL復溶液重懸。優化判定原則和依據參考曹海林[10]的方法，一般取加入抗體量最少，且檢測限抑制好的抗體加入量為抗體的最小標記量，最佳標記量按照最小標記量的1.2倍計算。

（3）離心力優化 為進一步提高金標抗體結合力度，保證金標抗體活性，本研究應用不同離心力對金標抗體進行結合力度優化。具體做法為：按照3 000、5 000、8 000、12 000 r/min離心8 min，離心完后觀察上清液是否澄清及探針是否容易重懸。

1.2.3 金標卡的制備（1）樣品墊優化 樣品墊的選擇：選取玻璃纖維素膜GL-01、GL-02、GL-03、GL-04作為樣品墊，用相同的配方處理這4種樣品墊，進行樣品測試。

樣品墊的處理條件優化，按照表1配制6種樣品墊處理液（以PBS為基質溶液），將樣品墊裁剪后放入處理液中，對比市場上常見的不同配方對樣品墊的影響情況。

表1 樣品墊處理液配方 單位：%

（2）吸水紙 吸水紙判斷的標準與樣品墊不一致。對比市場上常見的HS01、HS02、HS03這3種吸水紙，在吸水紙上添加30 μL中性紅溶液，在50 s內比較溶液在吸水紙上的吸收情況，直到吸水紙完全飽和。通過測定吸水紙的吸水率來比較不同吸水紙的吸水效果，吸水率的計算公式為：吸水率=（吸水紙濕重一吸水紙干重）÷吸水紙干重×100%。

（3）NC膜 T線：將包被抗原稀釋成0.5、0.8、1.0 mg/mL，包被至NC膜上，根據T線陰性顯色選擇及檢測限選擇最適T線包被濃度。C線：將二抗濃稀釋成0.5、1.0、1.5 mg/mL，包被至NC膜上，根據C線與T線陰性顯色選擇最適C線包被濃度。

（4）金標墊 金標墊采用45℃恒溫干燥和20℃~25℃自然干燥。干燥時間為15、30、45和60 min。確定最優的干燥方式和時間。

（5）組裝 試紙條的組裝就是將NC膜、金標墊、樣品墊和吸水紙按照一定的順序粘貼PVC板上。

1.2.4 卡片應用性檢測（1）靈敏度檢測 取克倫特羅標準品先用甲醇溶解，配制成10 μg/mL溶液，然后用PBS緩沖液將克倫特羅標準品稀釋為3、5、10、15、20和40 ng/mL，以PBS緩沖液作為陰性對照。陰性：T線、C線均紅色；陽性：T線不顯色，C線紅色；待克倫特羅的濃度達到用肉眼無法觀察到檢測線（T線），而控制線（C線）比較明顯時，的濃度便為所制備的試紙條的檢出限。

（2）特異性檢測 取克倫特羅相似物萊克多巴胺、沙丁胺醇和妥布特羅，分別用甲醇溶解，再用PBS緩沖液稀釋成濃度為5、10、15、20、40、100 ng/mL，用空白溶液作為陰性對照。觀察不同類似物在試紙條上的顯色情況。

（3）準確度檢測 組織處理：稱取（2±0.01）g均質后的樣品于50 mL離心管中，加入6 mL組織稀釋液，渦動2 min，5 000 r/min，離心10 min。用RIDA C18柱純化，取80 μL（稀釋4倍）測定。檢測：按照試劑盒的要求，依次加入標品和樣品、酶標記物，經過孵育洗滌后，加入底物，室溫避光反應15~20 min，最后加入終止液，在450和630 nm處讀OD值。計算樣品含量。

2 結果與分析

2.1 克倫特羅單抗的制備以及效價檢測

2.1.1 單克隆抗體的鑒定經間接ELISA檢測、染色體計數、SDS-PAGE電泳和ELISA單克隆抗體亞型檢測試劑盒檢測可知，單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 kDa，染色體數目為83~91條，親和常數為2.51×108 M?1。

2.1.2 抗體的交叉反應率選擇與克倫特羅類似結構或功能的藥物，替代克倫特羅標準溶液，測定其標準曲線，并計算IC50抑制濃度，計算交叉反應率。結果發現，單克隆抗體對克倫特羅的交叉反應為100%，對沙丁胺醇的交叉反應率為12%，對特布他林的交叉反應率為8%，對西馬特羅、維多洛爾和萊克多巴胺的交叉反應為0.2%，對普萘洛爾、阿替洛爾、間羥胺、拉貝洛爾、氧烯洛爾、異丙腎上腺素、腎上腺素和去甲腎上腺素的交叉反應均<0.1%。

選擇與克倫特羅類似結構或功能的藥物，替代克倫特羅標準溶液，測定其標準曲線，并計算IC50抑制濃度，計算交叉反應率，結果見表2。

表2 抗體交叉反應率 單位：%

2.2 標記條件優化結果

2.2.1 pH條件確定結果顯示：根據膠體金標記的原理，只有在pH接近和稍高于蛋白質的等電點時，膠體金蛋白質的吸附力最強；pH過高過低都不利于兩者的結合，圖1顯色當pH為8時，T線顯色最深，所以最適pH為8。

圖1 pH條件優化圖

2.2.2 抗體標記量條件確定抗體標記量條件優化結果如表3所示。

膠體金標記的2個關鍵環節是標記時的pH和最佳蛋白質標記量的確定。膠體金與被標蛋白質的用量比例是否合適是影響標記成功的一個重要因素。過多蛋白質標記，在造成浪費的同時，又會引起試紙的拖帶現象；過少蛋白質標記又會導致膠體金標記不完全，從而降低試紙的靈敏度及假陽性現象的出現。隨著抗體標記量的增加，陰性顯色也會增加，但是當抗體標記量大于10 μL/mL時，陰性顯色會變淺，并且檢測限抑制也會變差。當抗體標記量在10 μL/mL時，陰性T線顯色及檢測限顯色梯度最大，所以最佳抗體標記量為10 μL/mL的120%，即為12 μL/mL（表3）。

表3 抗體標記量條件優化結果

2.2.3 離心力優化當離心力為3 000、5 000 r/min時，上清液渾濁，說明離心力不夠，還有一部分膠體金沒有離心下來。當離心力為8 000、12 000 r/min時，上清液澄清，但是離心力為12 000 r/min時，探針不容易重懸，說明最佳離心力為8 000 r/min。

2.3 金標卡制備優化

2.3.1 樣品墊優化樣品墊優化結果如圖2所示。圖2結果表明，4種規格的樣品墊中，3號樣品墊顯色最深，而且線條均一，故選擇GL-03型樣品墊。

圖2 樣品墊優化結果

圖3左圖顯示的是相同的時間里陰性樣本對照。可看出，配方1、2顯色比較好，配方3、4、5次之，配方6出現中空現象；但是從右圖的陽性對照看，配方1、2、3、4不能完全消線，而配方5可以完全消線。因此，選擇配方5，優化確定樣品墊的處理配方為0.01 mol/L pBS+1%BSA+1%吐溫?20。

圖3 樣品墊處理配方的結果

2.3.2 吸水紙3種樣品墊對中性紅溶液的吸收情況表明，HS01、HS02、HS03吸水率分別為159.2、123.4、129.5，這也說明HS01吸水紙的吸水量最大，故選擇HS01吸水紙。

2.3.3NC膜（1）T線濃度確定 T線濃度顯色結果如表4所示。結果表明，隨著包被抗原濃度的增加，檢測線（T線）的顯色越來越明顯，當抗原包被濃度為1.0 mg/mL時，T線陰性顯色及檢測限顯色差異最大，所以T線最適包被濃度為1.0 mg/mL。

表4 T線濃度確定結果

（2）C線濃度確定 C線濃度確定結果如表5所示。結果表明，隨著二抗包被濃度的增加，質控線（C線）的顯色越來越明顯，當二抗包被濃度為0.5 mg/mL時C/T線顯色基本一致，所以C線最適包被濃度為0.5 mg/mL。

表5 C線濃度確定結果

2.3.4 金標墊干燥方式優化不同干燥方式對試紙條顯色效果的影響如表6所示。從表6可以看出，干燥30 min顯色效果劣于干燥45和60 min，室溫干燥優于加熱干燥，可能在加熱時，金標抗體在泳動時集中在NC膜的兩邊，導致顯色效果不佳。故室溫干燥45 min為最佳條件。

表6 不同干燥方式對試紙條顯色效果的影響

2.4 卡片應用性檢測

2.4.1 靈敏度檢測靈敏度檢測結果（表7）表明，克倫特羅檢測卡在1 ng/mL標準品時T線顯色略微有影，3 ng/mL標準品時T線不顯色，說明克倫特羅檢測卡的靈敏度為3 ng/mL。

表7 靈敏度檢測結果

2.4.2 特異性檢測特異性檢測結果（表8）表明，添加不同濃度的萊克多巴胺、沙丁胺醇、妥布特羅標準品，對克倫特羅檢測卡均未發生抑制作用，說明克倫特羅檢測卡特異性比較好。

表8 特異性檢測結果

2.4.3 準確度檢測

共檢測了150個豬組織樣品，比較上述2種方法的檢測結果。ELISA陽性豬組織樣品16份，陽性率10.67%；膠體金法豬組織樣品14份，陽性率9.33%，2種檢測方法陽性率無統計學差異（p>0.05）。本研究研制的克倫特羅檢測卡與酶聯免疫吸附法測定值符合率較高。

3 結論

鹽酸克倫特羅被國家明令禁止使用。本文優化克倫特羅單抗的制備方法，單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 kDa，染色體數目為83~91條，親和常數為2.51×108 M?1，得到最佳的標記條件pH=8、最佳抗體標記量為10 μL/mL的120%（12 μL/mL）、最佳離心力為8 000 r/min。與傳統的卡片相比，本研究對樣品墊、吸水紙、金標墊干燥方式進行探索與優化，優化確定樣品墊的處理配方為0.01 mol/L pBS+1% BSA+1%吐溫-20，選擇HS01吸水紙作為吸水紙，金標墊干燥方式為室溫干燥45 min。得到的膠體金卡準確度、靈敏度、保質期更優。經試驗，本研究克倫特羅檢測卡檢出限為3 ng/mL，優于市面上的檢測卡片，與萊克多巴胺、沙丁胺醇和妥布特羅無交叉反應，特異性好，與酶聯免疫吸附法測定結果符合率良好，準確度高，適宜在屠宰場、產品驗收場等現場的初篩檢測活動。