固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中甲氰菊酯含量的不確定度評定

曾永明 黃小芮 欒潔 蒙芳慧 周靜萱 陳松武

（廣西壯族自治區林業科學研究院 廣西南寧 530002）

中國是茶葉的故鄉，茶禮有緣，古已有之。種茶歷史悠久，敬茶禮節嚴格，飲茶風俗奇特，飲茶至今已有4 700多年歷史。中國是種植茶葉國家之一，特別在中國南方地區均廣泛種植茶葉。在優良的茶葉生產種植過程中，需要對品種、自然環境條件、管理方式以及加工技術等嚴格管理：一是保護好茶葉的種植環境，降低污染源的產生；二是通過種豆科類綠肥、鋪蓋稻草等綠色農藝措施提升地力來減少農藥的使用量，降低農殘和重金屬污染；三是做好病蟲害綜合防治工作，以蟲制蟲，促進茶園生態良性循環。但是目前，我國大部分茶園還處于粗放經營階段，經營管理工作尚不夠完善。此外，部分地區因大量施用農藥，環境受到嚴重污染，環境中的農藥通過食物鏈傳遞并富集，進入人體，長期食用農殘超標的農產品將危害人體健康。在茶區調研中，茶農紛紛反映，在噴施農藥時，好壞不分，往往把益蟲一起殺死，而且效果也不夠理想。最令人擔憂的是，精制出的成品茶中，存在不同程度的農藥殘留，這一點應引起高度重視，政府監管部門應該加強監督管理，真正實現食品生產過程中從“農田到餐桌”的全程監管。因此，市場監督和監測成了控制產品質量的最后一道關口，也是保障人民身體健康最重要的一道防線。茶產業的農殘污染問題是食品安全的關鍵因素，對于整個產業的穩定發展起著重要的作用。

甲氰菊酯(Fenpropathrin)，是20世紀七八十年代迅速發展起來的擬除蟲菊酯類殺蟲殺螨劑，化學名稱為α-氰基-3-苯氧基芐基-2,2,3,3-四甲基環丙烷酸酯，分子式為C22H23NO3，在世界各國廣泛使用。C22H23NO毒性中等，有觸殺、胃毒和一定的驅避作用，屬神經毒劑，使昆蟲因神經系統過度興奮、麻痹而死亡，無內吸和熏蒸活性。甲氰菊酯具作用迅速、殺蟲譜廣、擊倒作用強、持效期長、高效、快速、長殘效等特性，其最大特點是對多種害蟲和葉螨同時具有良好的防治效果，特別適合用于預防茶樹害蟲茶尺蠖、茶毛蟲和茶小綠葉蟬[1]。但在實際生產過程中，部分相關人員存在超量使用農藥的現象，致使食品中農藥殘留，可能對人體健康造成潛在的不良影響[2-3]。在食品安全監測工作中，準確地測量農產品中甲氰菊酯含量，對維護食品安全具有重要意義。目前需要依靠第三方檢測機構準確的測量結果來幫助維護食品安全工作，而測量過程中人為操作因素、環境因素、標準物質和儀器設備等方面都會對結果的不確定度造成影響[4-5]。為了提高測量結果的可靠性，找出影響測量結果的最主要因素，本研究參照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[6]，采用固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中甲氰菊酯的含量，通過評定不確定度的方式，對測量過程中可能造成誤差的操作進行測算，確定影響測量結果的主要因素，以改進農殘測量的精準性，對保障茶葉質量安全具有一定作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備MS3 basis旋渦混合器（IKA儀器有限公司）；離心機TD5A-WS（湘儀離心機儀器有限公司）；M32自動高通量平行濃縮儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；VM24固相萃取裝置（天津博納艾杰爾儀器有限公司）；GC-2010Plus氣相色譜儀（日本島津公司）；配備電子捕獲ECD檢測器，色譜柱：SH-Rtx-1（30 m×0.25 mm× 0.25 μm毛細色譜柱)。

1.1.2 測量儀器電子天平，最大允許誤差為±0.5 mg；瓶口分液器，最大允許誤差為0.03%；10 mL移液管，精度0.02 mL；0.1~1.0 mL移液槍，誤差范圍為±1%；20~200 μL移液槍，誤差范圍為±1%；10.00 mL容量瓶，精度0.10mL；ECD檢測器的定量允差1.2%等。

1.1.3 標準物質甲氰菊酯，購于農業農村部環境保護科學監測研究所，濃度為100 μg/mL，不確定度U=±3%（k=2）。

1.1.4 化學試劑乙腈（色譜純，上海安譜公司）；正己烷（色譜純，上海安譜公司）；丙酮（色譜純，上海安譜公司）；氯化鈉（分析純，西隴科學股份有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，西隴科學股份有限公司）；二級水（自制）。

1.1.5 耗材FLORISIL SPE小柱(1 g，6 mL)（上海安譜公司）；13 mm×0.2 μm有機濾膜（上海安譜公司）。

1.1.6 測定樣品茶葉，來自廣西壯族自治區市場管理局組織的能力驗證機構。

1.2 方法

1.2.1 標準工作溶液的配置從冰箱取出濃度為100 μg/mL的甲氰菊酯標準溶液放在室溫為25℃的實驗室回溫4 h后；用20~200 μL移液槍移取100 μL甲氰菊酯標準溶液于10.00 mL容量瓶中，用正己烷稀釋定容至刻度，配制成濃度為1 μg/mL的工作標準溶液（此工作標準溶液保存在4℃冰箱中，有效期一周）。檢測時通過稀釋在室溫為25℃的實驗室回溫4 h的工作標準溶液，得到0.10、030、0.50、0.70、1.00 μg/mL共5個梯度濃度的標準溶液；采用GC-2010Plus氣相色譜儀進行甲氰菊酯含量測定，每一濃度的標準溶液分別進樣3次，得到相應的色譜峰面積，用最小二乘法擬合得到標準曲線回歸方程。

1.2.2 供試品溶液的制備實驗樣品為已粉碎的茶葉樣品，由廣西壯族自治區市場管理局組織的能力驗證機構加入甲氰菊酯農藥。準確稱取茶葉樣品和空白樣品各2.00 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入18 mL蒸餾水渦旋1 min復原至茶葉鮮樣狀態，靜止30 min使茶葉充分浸潤；然后加入20 mL的乙腈和3~5 g氯化鈉，用渦旋混合器渦旋2 min，采用TD5A-WS離心機4 000 r/min離心5 min；用10 mL移液管吸取10 mL上層乙腈溶液到15 mL離心管中，調節M32自動高通量平行濃縮儀水浴溫度不大于40℃，以氮氣流量6 psi吹至近干；加入2 mL正己烷，渦旋1 min，蓋上蓋子，待凈化[7]。

1.2.3 提取液的凈化和定容首先向FLORISIL SPE小柱（1 g，6 mL）中填充約2 cm厚的無水硫酸鈉，放入VM24固相萃取裝置中，按表1操作步驟進行固相萃取操作：在FLORISIL SPE固相萃取小柱中，首先加入5.00 mL正己烷＋丙酮混合液，以1.0 mL/min流速潤洗FLORISIL SPE小柱進行活化；接著加入5.00 mL正己烷；以1.0 mL/min流速平衡SPE小柱；然后以1.5 mL/min 流速把待凈化樣品提取溶液上樣于SEP小柱中進行凈化；最后洗脫，調節流速為1.5 mL/min，依次用2.5 mL正己烷+丙酮（9∶1）進行洗脫，用15 mL離心管收集洗脫液約8~9 mL。在M32自動高通量平行濃縮儀上控制水浴溫度不高于40℃，調節氮氣流量為6 psi，將收集的洗脫液氮吹濃縮至近干；用移液槍正確加入1 mL正己烷，在渦旋混合器渦旋1 min，過0.2 μm有機濾膜，裝瓶上機測定。

表1 提取液凈化和定容操作步驟

1.2.4 氣相色譜條件毛細管色譜柱：SH-Rtx-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始溫度180℃保持8 min，以15℃/min速度升至220℃，保持1 min，再以30℃/min升至250℃，保持10 min；進樣體積：1 μL；進樣口溫度：250℃；分流比1∶50；ECD檢測器溫度：280℃；氮氣流速：30 mL/min；柱流速：2 mL/min。

2 結果與分析

2.1 數學模型的建立

分別稱取10組試樣，進行平行試驗，用外標法定性和定量，試樣中農藥殘留量計算公式如下：

式（1）中：ω，試樣中農藥殘留量，mg/kg；ρ，標準溶液中農藥的質量濃度，mg/L；A，樣品溶液中被測農藥的峰面積；As，農藥標準溶液中被測農藥的峰面積；V1，提取溶劑總體積，mL；V2，用于檢測的提取溶液的體積，mL；V3，樣品溶液定容體積，mL；m，試樣的質量，g。

2.2 測定不確定度分量來源分析

根據測量過程和公式（1），茶葉中甲氰菊酯含量測定不確定度的來源如下：

（1）配制標準溶液時引入的不確定度U1,rel，包括標準物質純度引入的不確定度U1，標準工作溶液稀釋過程中移液器引入的不確定度U2，容量瓶容量引入的不確定度U3，定容時人為讀數誤差引入的不確定度U4，定容時溫度變化引入的不確定度U5[8-10]；

（2）標準曲線引入的不確定度U2,rel[11]；

（3）稱樣時電子天平引入的不確定度U3，rel；

（4）添加萃取溶劑時瓶口分液器引入的不確定度U4,rel；

（5）移取萃取溶液時10 mL刻度吸管引入的不確定度U5,rel；

（6）固相萃取過程中引入的不確定度U6,rel；

（7）樣品定容時1 mL移液槍引入的不確定度U7,rel；

（8）氣相色譜儀自動進樣引入的不確定度U8,rel；

（9）ECD檢測器響應值引入的不確定度U9,rel；

（10）重復測量的相對不確定度U10,rel（A類）。

試驗所用試劑均為色譜純，因而空白樣品測定所致的不確定度影響很小，可忽略不計。

2.3 各不確定度的評定

2.3.1 配制標準溶液時引入的不確定度U1,rel

2.3.1.1標準物質純度引入的不確定度U1[12]根據標準物質證書，甲氰菊酯標準物質的濃度為100 μg/mL，不確定度為0.12 μg/mL，按矩形分布計算，k= 3，則：

2.3.1.2標準工作液稀釋過程中移液槍引入的不確定度U2用移液槍移取100 μL甲氰菊酯標準品溶液于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，配成標準工作液。移液槍說明書給出誤差范圍為±1%，按矩形分布計算則：

2.3.1.3標準溶液定容過程中容量瓶引入的不確定度U3A級單標線10 mL容量瓶最大誤差為±0.10 mL，按矩形分布計算，k＝ 3，則：

2.3.1.4定容時讀數誤差引入的相對不確定度U4定容時人為讀數誤差引入的不確定度可根據重復讀取實驗數據進行計算，表2為10 mL容量瓶重復6次定容實驗結果，根據表2中的數據計算得：

表2 10 mL容量瓶重復定容實驗結果 單位：mL

2.3.1.5定容時溫度引起體積變化引入的不確定度U5試驗在25℃條件下進行，而容量瓶是在20℃校準的，正己烷體積膨脹系數為1.36×10–3℃–1，容量瓶和溶液溫度與校準時不同所引起的體積變化為：±100 mL×5℃×1.36×10–3℃–1=0.68 mL，按矩形分布計算，則：

擬合以上5項得出配制標準溶液時引入的不確定度為：

2.3.2 標準曲線引入的不確定度U2,rel實驗經過初篩，確定配置5個梯度濃度的甲氰菊酯標準溶液，其濃度分別為0.10、0.30、0.50 、0.70、1.00 μg/mL，采用GC-2010Plus氣相色譜儀進行甲氰菊酯含量測定，每一濃度的標準溶液分別進樣3次，得到相應的色譜峰面積[5]（n=15，詳見表3）。

表3 標準系列溶液色譜峰面積測量結果

用最小二乘法擬合得到線性回歸方程為Y=173 694x+637.352，R2=0.999[13-14]。同時對茶葉樣品溶液中甲氰菊酯的濃度重復測定3次，由線性回歸方程計算得樣品溶液的質量濃度分別為0.60、0.59、0.61 mg/kg，平均值為0.60 mg/kg，則用標準曲線求得樣品溶液濃度引入的相對不確定度按式（8）計算：

式中：S，標準校正曲線殘差的標準偏差；對樣品中甲氰菊酯濃度進行3次測定，由線性回歸方程求得樣品的平均質量濃度，0.60 mg/L；a，線性回歸方程的斜率；N，樣品平行測定次數，N=3。將相關數據代入式（3），得：U2,rel=0.024。

2.3.3 樣品稱量時天平引入的相對不確定度U3,rel根據電子天平的檢定證書，其最大允許誤差為±0.5 mg。實驗中稱取m=2 g（2 000 mg）樣品，按矩形分布計算，則稱重標準不確定度為：

2.3.4 添加萃取溶劑時瓶口分液器引入的不確定度U4,rel根據瓶口分液器說明書，移取20 mL乙腈萃取溶劑，其最大允許誤差為0.03%×20 mL=0.006 mL，按均勻分布計算，k= 3，則：

2.3.5 移取萃取溶液時10 mL刻度吸管引入的不確定度U5,rel

2.3.5.1移液管體積刻度的不確定度依據JJG 196—2006《常用玻璃量器》，10 mL刻度吸管(A級)容量允差為±0.050 mL，按均勻分布，標準不確定度為：0.050/3＝0.029 mL[15]。

2.3.5.2液體充滿至移液管刻度線的估讀誤差依據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，移液管刻度線誤差經驗值為0.02 mL，按均勻分布，標準不確定度為：0.02/3=0.012 mL[16]。

2.3.5.3溫度變化引入體積變化的標準不確定度實驗在25℃條件下進行，水的膨脹系數為2.1×10–4/℃-1，按均勻分布，溫度變化引起的標準不確定度為：

合成以上3項得出10 mL分刻度吸管不確定度為：

2.3.6 固相萃取過程中引入的不確定度U6,rel固相萃取過程需要經過SPE的活化/平衡、上樣、洗脫、濃縮、定容等步驟，很難確定每一步驟對測量結果不確定度的貢獻，實驗中一般采用方法的回收率對固相萃取過程引入的不確定度進行評定[13]。取7份茶葉樣品，其中1份作為空白，其它6份分別加入0. 60 μg/mL標準溶液，經同樣品測定進行平行試驗。精密度和回收率結果如表4所示，回收率的標準差：

表4 回收率測定結果

2.3.7 樣品定容時1 mL移液槍引入的不確定度U7,rel樣品經氮吹濃縮后定容過程的不確定度主要由1 mL移液槍產生，用移液槍移取1 mL正己烷定容，根據移液槍檢定證書給出誤差范圍為±1%，按矩形分布計算，k= 3，則[17]：

2.3.8 氣相色譜儀自動進樣引入的不確定度U8,rel進樣體積引入的不確定度主要源于自動進樣器進樣針體積重現性。根據本氣相色譜儀自動進樣器技術參數（進樣體積為1 μL，進樣重現性不大于0.5%），按矩形分布計算（B類評定，k[18]，則：

2.3.9ECD檢測器響應值引入的不確定度U9,rel氣相色譜儀靈敏度較高，故儀器穩定性及測定值分散性是ECD檢測器測量不確定度的主要來源。采用標準工作溶液連續測定8次，測得質量濃度數據見表5，以質量濃度值的分散性計算相對不確定度：

表5 標準工作溶液重復測定實驗結果

2.3.10 重復測量的相對不確定度U10,rel（A類）測量茶葉樣品中甲氰菊酯質量濃度，共進行了10次平行試驗，結果見表6。

表6 平行試驗結果值

3 不確定度的合成與擴展

3.1 合成相對標準不確定度

標準不確定度分量來源、量值、貢獻率見下表7。

表7 標準不確定度分量匯總

利用U1,rel~U10,rel不確定度分量結算結果計算合成相對不確定度[19-20]，得：

實驗測得茶葉樣品中甲氰菊酯質量濃度為0.60 mg/kg，合成標準不確定度為：Uc(rel)=Urel×x=0.034×0.60 mg/kg=0.020 mg/kg

由表7可知，測量茶葉中甲氰菊酯含量過程中，不確定度的來源影響大小為標準工作曲線＞重復測量＞固相萃取過程＞ECD檢測器＞標準溶液配置＞10 mL分刻度吸管＞自動進樣器＞瓶口分液器＞樣品稱量＞1 mL移液槍；其中標準工作曲線、重復測量、固相萃取過程、ECD檢測器和標準溶液配置引入的不確定度較大，貢獻率達35.74%、31.27%、14.29%、6.85和6.25%。

3.2 擴展不確定度

取95%的置信概率，包含因子k=2，則擴展不確定度U(x)=k×Uc(rel)=0.040 mg/kg。因此，采用固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中甲氰菊酯濃度，當測量的數據為0.60 mg/kg時，測量的結果表示為（0.60±0.040）mg/kg，k=2。

4 討論與結論

4.1 標準物質的使用

檢驗用的標準物質或標準溶液的準確性直接影響到定量結果的準確性和可靠性。標準物質的溯源性至關重要，實驗應使用有證的標準物質。本試驗為農藥殘留的能力驗證活動，對于標準溶液的要求相對來說比較高，具體有以下幾個方面：一是農殘標液應該購買新生產的，因為農藥具有不穩定性，在光、熱影響下容易發生分解及轉化；二是農殘標液應在符合標液證書的保存條件下進行保存；三是農殘的標液不確定度相對來說比較大，因此最好采用液標和固體標準物質的配制溶液進行比較，以確保其可靠性；四是配制農殘標準溶液時要注意介質的使用，根據母液與農藥的溶解性、樣品檢驗標準方法中的提取液及定容上機的溶劑來進行選擇。

4.2 樣品的保存和前處理

一是農藥殘留量本身比較低，而且農藥具有不穩定的特性，因此實驗室在接到樣品后應立即進行實驗，無法馬上進行實驗的應將樣品處于（0~4）℃冷藏箱中避光保存；二是由于樣品是經過冷藏的，在進行實驗之前最好將樣品放置至室溫后再進行稱樣，否則易吸收空氣中的水分造成稱量誤差；三是樣品的前處理要根據檢驗方法選擇合適的有機溶劑，提取方式、時間應按照檢驗方法的要求嚴格進行，否則會出現提取不完全的情況；四是由于茶葉樣品中的成分比較復雜，樣品中的色素及脂類成分都可能影響實驗結果，所以最好對提取液進行有效的凈化處理，而且要進行多次洗脫，使目標組分全部轉移到提取溶液中，避免組分的損失。

4.3 儀器設備

一是農殘分析對于儀器的要求比較高，實驗前應該對儀器的進樣針、氣路、色譜柱、檢測器等進行清洗及凈化，使樣品分析過程中不受污染；二是分析檢測時要確保分析儀器處于穩定狀態，參數設置及分析條件優化到最佳狀態，實驗室應根據所用儀器型號將儀器調整至最佳狀態；三是為了避免系統誤差，條件允許的情況下，可以用多臺儀器進行結果比較，而且要注意進樣過程中試劑的揮發對結果造成的影響。

4.4 檢驗人員

一是檢驗人員在實驗前應熟悉檢驗方法標準，掌握檢測方法基本原理，實驗過程要求做到操作規范、熟練，嚴格按檢測方法的要求對樣品中的目標組分進行檢測；二是檢驗人員應熟知保證結果準確性的驗證方法，比如通過進行加標實驗，將加標實際結果與理論結果相比較，如果出現回收率過高或過低的情況應及時進行原因分析并糾正；三是檢測人員應考慮農殘的檢測中各種因素的影響，比如樣品中的基質效應對農殘結果影響很大，因此應該通過基質曲線加標的方式將這個影響降低到最小。

因此，用固相萃取-氣相色譜法測定茶葉甲氰菊酯的過程中，應選用有證的標準物質，精度較好的量器，規范移液管和容量瓶的操作，確保配置標準工作溶液濃度的準確性；選擇擬合線性高的工作曲線進行校準；規范樣品的保存和前處理步驟；對分析儀器進行日常維護和按時檢定；加強檢驗人員的檢測技術培訓，適當增加平行樣來降低不確定度，提高檢測結果的準確性。

本試驗采用固相萃取–氣相色譜法測定茶葉中甲氰菊酯濃度，測量不確定度主要來源于甲氰菊酯標準工作曲線、重復測量、固相萃取過程、ECD檢測器和標準溶液配置，貢獻率分別為35.74%、31.27%、14.29%、6.85和6.25%，其中標準曲線引入的不確定對測量結果的影響最大。