高產(chǎn)Monacolin K紅曲霉的誘變選育及其與釀酒酵母共酵培養(yǎng)

沙見宇，裴 歡，劉 曦，閆雪秋

（北京北大維信生物科技有限公司，北京 100094）

紅曲是指以大米為原料，接種紅曲霉經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而成的紅曲米[1]。現(xiàn)代研究表明，紅曲發(fā)酵產(chǎn)物含有莫納克林K、紅曲色素、γ-氨基丁酸、支鏈氨基酸、麥角固醇、酶類活性物質(zhì)等多種有益成分[2-3]。莫納克林K是紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中的主要活性成分，莫納克林K以酸型（開環(huán)）和內(nèi)酯型（閉環(huán)）兩種形態(tài)存在，其中內(nèi)酯型莫納克林K的穩(wěn)定性較酸型莫納克林K更高。在酸性條件下，酸型莫納克林K會(huì)向內(nèi)酯型不斷轉(zhuǎn)化[3]，內(nèi)酯型莫納克林K具有降血脂、降膽固醇的活性。

羥甲基戊二酰單酰輔酶A（hydroxymethylglutaryl CoA，HMG-CoA）還原酶是人體中膽固醇生物合成限速酶，而莫納克林K可以與HMG-CoA還原酶受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制HMG-CoA還原酶活性，進(jìn)一步減少膽固醇的合成[4-5]。同時(shí)，莫納克林K還可以通過提升肝細(xì)胞膜上的低密度脂蛋白受體的數(shù)量、活性及其親和力，促使膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁而排出體外，從而降低血漿中的膽固醇含量[6]。

在提高紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K的方法中，常見的有菌種分離鑒定[7]，發(fā)酵工藝優(yōu)化[8]、誘變育種[9]、基因編輯[10]等方法；還有一些新興的育種技術(shù)，如常壓室溫等離子體[11]、氮離子束[12]、高能混合粒子場(chǎng)[13]等。紫外誘變即通過以紫外線照射微生物，促使微生物核酸上的嘌呤和嘧啶堿基生成嘧啶二聚體，從而阻礙堿基之間的正常配對(duì)，導(dǎo)致微生物發(fā)生突變甚至死亡，提高突變頻率，通過適當(dāng)?shù)姆椒êY選育種[14]。共酵培養(yǎng)則是通過將紅曲霉菌與其他菌液混合一起參與發(fā)酵，目前已報(bào)道的研究表明，紅曲霉菌與多種酵母進(jìn)行共酵均可提高發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K含量[15-16]。但以往研究中大多只采用一種方法提高莫納克林K產(chǎn)量，對(duì)同時(shí)采用紫外誘變和共酵的研究報(bào)道較少。該研究選用紫外誘變篩選紅曲菌株，結(jié)合與釀酒酵母共酵培養(yǎng)的方法，以期進(jìn)一步提高紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）MY-11：實(shí)驗(yàn)室保藏；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2.2084：中國普通微生物菌種保藏管理中心；葡萄糖、七水硫酸鎂、無水氯化鈣、磷酸二氫銨、蛋白胨（均為分析純或生化試劑）、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；大米粉：五常市萬福米業(yè)有限公司；土豆：市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；乙腈、三氟乙酸（均為色譜純）：美國Fisher公司；莫納克林K標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：中國食品藥品檢定研究院；超純水：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：取PDA培養(yǎng)基干粉46.0 g，加入1 000 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌30 min，備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[17]：葡萄糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，NH4H2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，以土豆汁溶解上述藥品，121 ℃滅菌20 min。

大米培養(yǎng)基[18]：大米粉38.5%，麩皮7.5%，水50%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1.5%，pH值為5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠有限公司；LRH-250-HSE恒溫恒濕培養(yǎng)箱：珠江泰宏君儀器設(shè)備有限公司；BXM-110VE立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份生物有限公司；WGL-230B電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW80高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；島津LC-20AT型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；KQ5200DE型超聲波清洗機(jī)：昆山合創(chuàng)超聲儀器有限公司；METTLER XPE205DR型電子天平：梅特勒托利多公司；超純水儀：美國PALL公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子菌懸液的制備

取一支斜面菌種，加入少量無菌水，用接種環(huán)刮下斜面上的孢子，裝入三角瓶中振搖15 min，使孢子充分散開，用帶有4層擦鏡紙漏斗過濾掉菌絲，定容至50 mL，制成孢子菌懸液。

1.3.2 紫外誘變方法[19]

取6份10 mL孢子菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，置于15 W紫外燈下30 cm處，分別照射0、10 s、20 s、30 s、40 s、60 s。取誘變后各照射時(shí)間段孢子懸液0.5 mL，稀釋至10-4。取各稀釋液0.1 mL涂布于固體培養(yǎng)基，30 ℃避光培養(yǎng)7 d，記錄平板菌落數(shù)，計(jì)算誘變致死率，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 菌株篩選

紫色紅曲霉初篩[20]：觀察平板上長出的菌落，挑取生長速度較快或形態(tài)、顏色變化的菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)。

紫色紅曲霉復(fù)篩：將篩選得到的紅曲霉菌株按照5%（V/V）接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)2 d。吸取液體種子于大米培養(yǎng)基中，攪拌混勻，30 ℃培養(yǎng)25 d，得到紅曲。按照1.3.6步驟進(jìn)行莫納克林K的檢測(cè)，篩選莫納克林K含量高的誘變菌株。

1.3.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將篩選得到的高產(chǎn)莫納克林K的誘變菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，通過HPLC法測(cè)定每代菌株發(fā)酵液的莫納克林K含量，分析誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5 共酵培養(yǎng)

將釀酒酵母于12°Bx的麥芽汁中進(jìn)行活化，28 ℃活化24 h，得到酵母菌液。將誘變菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，得到紅曲霉菌液。

將酵母菌液和紅曲霉菌液接入大米培養(yǎng)基內(nèi)，20%（以大米培養(yǎng)基為基準(zhǔn)）紅曲菌液體分別與0、1%、2%、3%、4%（109CFU/mL）的酵母菌液進(jìn)行共酵培養(yǎng)，攪拌混勻，30 ℃培養(yǎng)25 d，得到紅曲。

1.3.6 莫納克林K的測(cè)定

取紅曲采用HPLC法進(jìn)行莫納克林K的檢測(cè)。紅曲于90 ℃干燥24 h后，用高能粉碎機(jī)粉碎成紅曲粉。檢測(cè)紅曲粉中酸型莫納克林K和內(nèi)酯型莫納克林K的含量[21]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紫外照射時(shí)間下的致死率

不同紫外照射時(shí)間對(duì)致死率的影響結(jié)果見圖1。對(duì)紅曲霉菌MY-11進(jìn)行紫外誘變，采用致死率來考察紫外線對(duì)紅曲霉的損傷作用。為獲得較高的正突變率，方便誘變菌株的篩選，選取致死率在70%～80%的最佳[22]。由圖1可知，紫外誘變劑量達(dá)到20 s時(shí)，紅曲菌的致死率達(dá)到76%，所以確定紫外誘變的最佳照射時(shí)間為20 s。

圖1 紫外誘變時(shí)間對(duì)致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on lethality

2.2 產(chǎn)莫納克林K菌株的篩選

以紫色紅曲霉MY-11為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，經(jīng)菌落形態(tài)初篩，獲得紫外誘變菌株8株，編號(hào)為M1～M8，分別對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵并測(cè)定莫納克林K的含量，檢測(cè)其是否高于出發(fā)菌株莫納克林K的含量，測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，與出發(fā)菌株相比，誘變菌株M7、M8的莫納克林K的含量均有較大提高，含量分別達(dá)到了12.42 mg/g、12.49 mg/g；相比出發(fā)菌株MY-11分別提高了26%、27%，因此選擇誘變菌株M7和M8作為共酵培養(yǎng)的菌種。

表1 紅曲霉MY-11紫外誘變菌株復(fù)篩結(jié)果Table 1 Rescreening results of UV mutagenesis strains of Monascus MY-11

2.3 誘變菌株M7、M8產(chǎn)莫納克林K的穩(wěn)定性

單一紫外誘變初篩效果較好，但紫外誘變后的突變菌株性狀具有不穩(wěn)定性，傳代培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)性狀衰退，需要遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)M7和M8分別連續(xù)傳代5次，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)其莫納克林K產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

表2 紅曲霉誘變菌種的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of mutated Monascus strain

由表2可知，誘變菌株M7、M8傳代5次后，紅曲霉M7、M8傳代培養(yǎng)發(fā)酵的莫納克林K含量均有不同程度的下降，紅曲霉M8的衰減幅度明顯高于紅曲霉M7，M7的遺傳穩(wěn)定性優(yōu)于M8，與第一代菌株相比，第五代的菌株莫納可林K產(chǎn)量分別降低了27%和39%。可能是因?yàn)閱我坏淖贤庹T變使得菌株易產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，引起菌種的活性代謝物質(zhì)減少[23]。

2.4 共酵培養(yǎng)對(duì)莫納克林K含量的影響

由于單一的紫外誘變方法使得紅曲霉產(chǎn)莫納克林K能力呈現(xiàn)衰退的趨勢(shì)，有研究表明，紅曲霉菌與多種酵母進(jìn)行共酵均可提高發(fā)酵產(chǎn)物中莫納克林K含量[15-16]。因此該研究采用與酵母共酵的方法繼續(xù)提高紅曲霉誘變菌株產(chǎn)莫納克林K的能力。為探究酵母共酵對(duì)莫納克林K產(chǎn)量的影響，以第5代的紫外誘變篩選菌株M7、M8為研究對(duì)象，分別與不同添加量酵母菌菌液共酵25 d，測(cè)定菌株的莫納克林K產(chǎn)量，結(jié)果見表3。

表3 紅曲霉M7、M8分別與酵母固態(tài)共酵25 d的莫納克林K含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of Monaklin K content of solid-state fermentation Monascus strains M7 and M8 with yeast for 25 d

由表3可知，酵母接種量的大小會(huì)影響紅曲霉M7發(fā)酵的莫納克林K含量。適宜的接種量有利于微生物的生長代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累[24-25]。當(dāng)酵母接種量為3%時(shí)，紅曲霉M7發(fā)酵的莫納克林K含量最高為9.35 mg/g，相比不加酵母液，提高了2.63%。同樣，當(dāng)酵母接種量為3%時(shí)，紅曲霉M8發(fā)酵的莫納克林K含量最高為8.94 mg/g，相比不加酵母液提高16.41%。當(dāng)接種量小于3%時(shí)，莫納克林K的含量較低，推測(cè)酵母在固態(tài)發(fā)酵過程中與紅曲霉共酵，釋放出較少對(duì)莫納克林K產(chǎn)量提高有益的誘導(dǎo)因子，不足以使產(chǎn)量顯著提高。當(dāng)接種量大于3%時(shí)，可能是由于引入的水分較多，不利于菌體的生長。可能由于紅曲霉與酵母共酵生長，能夠持續(xù)釋放更多對(duì)莫納克林K有益的誘導(dǎo)因子，使得含量提高[16]。朱蕊等[16]做過類似的研究，加入酵母共酵使得洛伐他汀的含量可達(dá)12.93 mg/g。綜上，添加適量的酵母菌對(duì)固態(tài)發(fā)酵有益，對(duì)于紅曲霉M7、M8，加入3%的酵母菌液共酵均能提高莫納克林K產(chǎn)量。

3 結(jié)論

為提高紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)莫納克林K能力，加快紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)莫納克林K工業(yè)化進(jìn)程。該研究以紅曲霉MY-11為原始菌株，經(jīng)紫外誘變篩選出M7、M8兩株誘變菌株，其莫納克林K含量分別達(dá)到了12.42 mg/g、12.49 mg/g；相比原始菌株MY-11分別提高了26%、27%。單一的紫外誘變方法使得紅曲霉產(chǎn)莫納克林K能力呈現(xiàn)衰退的趨勢(shì)，將誘變菌株M7、M8分別與釀酒酵母共酵培養(yǎng)25 d，發(fā)現(xiàn)加入3%的酵母菌液共酵均能提高莫納克林K產(chǎn)量，對(duì)比不加酵母液，分別提高了2.63%、16.41%。總體來說，單一紫外誘變相比共酵在提高菌株產(chǎn)莫納克林K含量上具有較大的優(yōu)勢(shì)，但紫外誘變存在遺傳穩(wěn)定性不足的缺陷，紫外誘變篩選結(jié)合共酵培養(yǎng)方法會(huì)提高紅曲中莫納克林K含量。后續(xù)研究采用復(fù)合誘變、優(yōu)化誘變菌株的發(fā)酵工藝等方法解決遺傳穩(wěn)定性不足等問題。