基于焦磷酸測序的CYP2C19*2、CYP2C19*3基因分型方法性能驗證*

張婕妤，初亞男，李玉嬌，封利穎

東部戰區總醫院臨床藥學科，江蘇南京 210002

藥物基因組學是一門研究與藥物吸收、代謝和轉運相關的遺傳因素如何影響藥物治療效果或不良反應的學科[1-3]。細胞色素P450 2C19(CYP2C19)是細胞色素P450超家族的一種同工酶，參與約2%的藥物代謝過程[4-5]。CYP2C19擁有的多種基因多態性表現為不同的酶活性，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3的多態性與氯吡格雷抵抗、質子泵抑制劑的療效相關[6-7]。臨床藥物基因組學實施聯盟(CPIC)、荷蘭藥物遺傳學工作組(DPWG)和加拿大藥物基因組學藥品安全網(CPNDS)均建議臨床在使用氯吡格雷和質子泵抑制劑等藥物前檢測CYP2C19基因型[8-9]。根據《醫學實驗室質量和能力認可準則(IS015189:2012.IDT) :CNA5-CL02》和江蘇省臨床檢驗中心對臨床基因擴增檢驗實驗室的要求[10-11]，任何一項用于常規檢測的項目在引入臨床使用前必須通過性能驗證。定性檢測的性能指標包括最低檢測濃度、準確度、特異度和重復性/精密度等。本文旨在對實驗室自建焦磷酸測序檢測CYP2C19*2(rs424485,c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893,c.636G>A)單核苷酸多態性的方法進行性能驗證，保證其檢測結果的準確、穩定及可靠。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年9月至2022年5月在東部戰區總醫院進行CYP2C19*2、CYP2C19*3單核苷酸多態性檢測的乙二胺四乙酸抗凝全血標本作為研究對象。

1.2儀器與試劑 Wizard?基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)；TaKaRa TaqTM(日本TaKaRa公司)；PyroMark Gold Q96 Reagents、Annealing buffer和Binding buffer(德國QIAGEN公司)；Streptavidin SepharoseTMHigh Performance(美國GE Healthcare Life Sciences公司)；屈臣氏蒸餾水。Q24焦磷酸測序儀(德國QIAGEN公司)；A200基因擴增儀(杭州朗基科學儀器有限公司)；微量紫外分光光度計(南京伍義科技有限公司)；VORTEX-GENIE 2渦漩混勻器(美國Scientific Industries基因公司)；Legand Micro 21R冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)。所有引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態性的引物序列

1.3方法

1.3.1基因組DNA(gDNA)提取 根據DNA提取試劑盒說明書提取血液標本中的gDNA。選取濃度≥30 ng/μL，A260/A280在1.8～2.0的gDNA標本儲存在-30 ℃冰箱中備用。

1.3.2PCR擴增 反應體系為50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，5 U Taq酶0.25 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，gDNA 1 μL，蒸餾水補全總體系至50 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；擴增35個循環(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 7 min。

1.3.3焦磷酸測序 取20 μL PCR產物、2 μL Sepharose、18 μL蒸餾水、40 μL Binding buffer振蕩混勻8 min，再制備單鏈至已加入1 μL 10 μmol/L的測序引物和24 μL Annealing buffer的24孔板中，80 ℃孵育30 s，室溫放置1 min。CYP2C19*2位點核苷酸推注順序為CCTTGA,CYP2C19*3位點核苷酸推注順序為GGAATC。檢測結果可由儀器分析后自動判讀，也可根據信號峰的比值來判斷。

1.3.4最低檢測濃度驗證 隨機挑選CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型分別為*1*2型和*1*3型的gDNA標本各1份，用DNA Rehydration Buffer梯度稀釋成10.0、2.0、0.4 ng/μL，每個濃度梯度設置3個復孔。

1.3.5準確度驗證 隨機選取20份臨床gDNA標本進行焦磷酸測序，并將擴增產物送至深圳市華大科技有限公司進行雙向Sanger測序驗證。

1.3.7特異度驗證 選取經焦磷酸測序驗證CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型均為*1*1型(野生型)的gDNA標本各10份，將其擴增產物送至深圳市華大科技有限公司進行雙向Sanger測序。

1.3.8臨床標本檢測 對2021年1月至2022年5月本院臨床科室申請進行CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態性檢測的144份血液標本進行焦磷酸測序。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據分析。計數資料以例數或百分率表示，Hardy-Weinberg平衡驗證采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1最低檢測濃度 由于雜合型標本的熒光強度只有野生型或突變型標本的一半，因此選擇CYP2C19*2和CYP2C19*3位點的雜合型標本進行檢測更能反映最低檢測濃度。不同濃度標本的焦磷酸測序結果與稀釋前結果比對一致，焦磷酸測序儀可分析濃度低至0.4 ng/μL的gDNA標本，故該方法的最低檢測濃度為0.4 ng/μL。

2.2準確度 20份臨床gDNA標本進行焦磷酸測序，分別檢測出9份CYP2C19*2*1*1型，10份CYP2C19*2*1*2型，1份CYP2C19*2*2*2型；19份CYP2C19*3*1*1型，1份CYP2C19*3*1*3型，未檢測出CYP2C19*3*3*3型。與Sanger測序驗證結果比對，兩種檢測方法結果完全符合(圖1)，焦磷酸測序方法準確度為100%。

注：A為CYP2C19*2*1*1型測序結果；B為CYP2C19*2*1*2型測序結果；C為CYP2C19*2*2*2型測序結果；D為CYP2C19*3*1*1型測序結果；E為CYP2C19*3*1*3型測序結果。

2.3特異度 10份CYP2C19*2和10份CYP2C19*3基因型均為野生型的gDNA標本，對其擴增產物進行雙向Sanger測序均未檢出突變型，檢測特異度為100%。

2.4重復性 CYP2C19*2*1*2型gDNA標本的兩個等位基因C和T的熒光信號值CV分別為4.20%和4.40%，CYP2C19*3*1*3型gDNA標本的兩個等位基因A和G的熒光信號值CV分別為3.75%和3.21%，均<5%，重復性驗證符合要求，見表2。

表2 CYP2C19*2*1*2和CYP2C19*3*1*3型重復性驗證結果

2.5臨床標本檢測 144份臨床標本的焦磷酸測序結果顯示，CYP2C19*2多態性位點*1*1型(野生型)71份(49.3%)，*1*2型(雜合型)59份(41.0%)，*2*2型(突變型)14份(9.7%)；CYP2C19*3多態性位點*1*1型(野生型)139份(96.5%)，*1*3型(雜合型)5份(3.5%)，未檢出*3*3型(突變型)標本(在中國人群中分布頻率極低)，分布情況符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

3 討 論

藥物基因組學結合了藥理學和基因組學，主要用于探索有效、安全的藥物和使用劑量，在精準醫學中有著重要的意義[12-14]。藥物基因組學的檢測可用于指導醫師采取更好的治療決策，根據人體的基因型精準選擇藥物及劑量[15]。CYP2C19是CYP2C酶體系的一員，其基因多態性可導致酶活性的差異[16]。CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態性是中國人群中常見的突變，分別會導致酶活性喪失和形成無活性的酶蛋白[17]。對于攜帶兩個CYP2C19*2和CYP2C19*3功能缺失性等位基因的患者，如果常規使用氯吡格雷，發生心血管事件的風險將明顯增加，因此治療前應進行CYP2C19基因型檢測，以減少不良事件發生風險[18-19]。奧美拉唑經CYP2C19代謝形成無活性的代謝產物，不同的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型會造成不同的人體血藥濃度，進而形成抑酸療效上的差異，因此需要針對基因型進行劑量調整[20]。

目前，檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態性的一些方法已通過性能驗證，但關于焦磷酸測序的方法學驗證報道少見。因此，本研究根據江蘇省臨床檢驗中心對擴增實驗室的要求和醫學界普遍執行的關于醫學實驗室能力要求的標準ISO15189，設計了4個方面的性能驗證。經驗證，本研究采用焦磷酸測序檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態性的最低檢測濃度為0.4 ng/μL；采用Sanger測序為參考方法，兩種方法測序結果完全符合，準確度為100%；特異度驗證中真陰性野生型標本均未檢出陽性突變，特異度良好；批內重復檢測4次結果穩定。上述結果提示該方法性能指標符合藥物基因組學檢測項目的要求，符合臨床基因擴增檢驗實驗室檢測質量要求。

綜上所述，本文建立的基于焦磷酸測序檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態性的方法準確、穩定、靈敏度高，能為臨床提供可靠結果，進而為臨床使用氯吡格雷、質子泵抑制劑和抗抑郁藥等提供個體化指導。