幾種常見微藻在尾水中生長差異及其產油潛力分析

譚靜雯 田為一 高 睿 盛嘉棋 任雨杰 甄樹聰

（鹽城工學院土木學院，江蘇鹽城 224001）

近年來，如何處理好水資源與能源危機一直是一個居高不下的熱點問題，顯然污水再生利用是一個極為重要的途徑[1-3]。在運用不同方法對污水進行再生利用的過程中，發現相比于常規的污水生物處理工藝技術，運用微藻深度處理污水是一個較為可取的方法，不僅因為可以利用菌藻共生系統中微藻在生長過程中可以吸收污水中氮、磷等營養物質并將其轉化為有機物或沉淀這一特性，還因為可以利用其細胞中含油量較高這一優點，萃取油脂并轉化成生物柴油，真正做到處理水廠尾水的同時緩解部分的能源匱乏問題[4-7]。本研究通過觀察幾種常見微藻在尾水中的生長差異并萃取油脂，對藻種的產油性能進行評價，為日后研究尾水可持續培養微藻并將其作為生物柴油奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 試驗儀器。紫外分光光度計、顯微鏡、培養箱、離心機等。

1.1.2 試驗材料。試驗水樣來自鹽城市城東污水廠尾水。試驗所用藻種均由指導老師提供，分別為銅綠微囊藻（藻種編號PCC-7806）、銅綠微囊藻（藻種編號FACHB-469）、有毒銅綠微囊藻（藻種編號PCC-7820）、蛋白核小球藻（藻種編號FACHB-5）。

1.1.3 試驗試劑。氨氮標準溶液、納氏試劑、酒石酸鉀鈉溶液、磷標準使用溶液、抗壞血酸溶液、鉬酸鹽溶液、無水乙醇。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設置與接種。選用容積為1 L的錐形瓶作為培養容器，用江蘇省鹽城市城東污水廠的尾水作培養基，分別培養4種不同藻類，記為4組。A組為PCC-7806，B組為PCC-7820，C組為FACHB-469，D組為FACHB-5。污水廠尾水中的氨氮濃度和總磷濃度為TN=2.41 mg/L、TP=8.12 mg/L。

試驗前用離心機將4種藻類以5 000 r/min的速度離心15 min，棄去上清液，再用無菌水洗滌3次，分別接入已滅菌的4組培養基中，放置在培養箱中培養，采用雙側可調光源，光強控制在4 500～5 000 lx，進行24 h光照，溫度控制在25.0～26.5℃[8]，每日手動對其進行搖晃2～3次，使得營養均衡。A組初始藻密度約為3.32×106個/mL，B組初始藻密度約為2.12×106個/mL，C組初始藻密度約為3.51×106個/mL，D組初始藻密度約為2.88×106個/mL。并分別在培養過程中的第1、3、5、7、9、11、13和15天對其數量及尾水中氮磷的含量進行檢測。

1.2.2 微藻的生長曲線。4種不同微囊藻的細胞密度采用血球計數板計數的方法進行計數，并繪制微囊藻的生長曲線圖。

1.2.3 微藻氨氮濃度變化的測定。采用納氏試劑分光光度法測定[9]。在8個50 mL比色管中，先配置好氨氮含量分別為0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和100μg的溶液并加蒸餾水至標線。再先后加入1 mL的酒石酸鉀鈉溶液和1 mL的納氏試劑搖勻。靜置10 min后，在波長為420 nm下，用20 mm比色皿，以零濃度溶液為參比，測量吸光度，并繪制出校準曲線。再將4種待測液體各取50 mL按照和校準曲線相同的步驟測量4種微囊藻的吸光度，并得到其氨氮濃度的數值。

1.2.4 微藻總磷濃度變化的測定。采用鉬酸銨分光光度法測定[10]。在7個50 mL比色管中，分別加入0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、10.0、15.0 mL的磷酸鹽標準溶液并加蒸餾水至50mL標線。向比色管中加入1 mL 10%抗壞血酸溶液，混勻。30 s后加2 mL鉬酸鹽溶液充分混勻，放置15 min。用30 mm比色皿于700 nm波長處，以零濃度溶液為參比，測量吸光度，并繪制出校準曲線。再將4種待測液體取適量經消解后分別加入50 mL比色管中，用水稀釋至標線。按照和校準曲線相同的步驟測量4種微囊藻的吸光度，并得到其總磷濃度的數值。

1.2.5 微藻比生長速率的測定。在藻種培養的第1天和最后1天分別取少量藻液，用分光光度計測量4種藻液在波長680 nm下的吸光度值，平行測量5次取平均。按以下公式計算4種藻種的比生長速率（d-1）：

式中，A1為接種培養第1天的吸光光度值OD680，A2為培養最后1天的吸光光度值OD680，T1和T2分別表示培養開始和結束的時間。

1.2.6 微藻生物量的測定。采用水廠尾水作培養基培養微藻，待其生長到指數生長末期收獲，將離心管在90℃烘箱中烘干至恒重（M1），取100 mL均勻藻液置于上述離心管中經離心機4000 r/min離心5 min。后用滅菌的蒸餾水清洗3次，清洗后經-20℃冰箱內冷凍2 h，然后將產物放置于烘箱中烘干至恒重（M2）。最后經過研磨，得到干藻粉。置于-20℃冰箱中凍存備用[11]。按以下公式計算生物量：

生物量（g/L）=（M2-M1）×10

1.2.7 微藻油脂含量的測定。參考文獻[12]中的乙醇法，將其略微改動，用來提取4種微藻中的油脂。取培養至指數生長末期的一定量干藻體，充分研磨后每克加入5 mL 96%的乙醇，振蕩搖勻。將混合溶液放入離心管在4 000 r/min的轉速下離心5 min，吸取上清液于已恒重的燒杯內，剩余的殘渣再加入5 mL 96%的乙醇離心吸取上清液于之前的燒杯里。將燒杯放置于水浴鍋中快速去除多余溶劑，取出后再放置于90℃的烘箱中干燥2 h，取出燒杯至冷卻后再稱重。按以下公式計算藻種油脂質量分數（%）：

油脂含量分數（%）=（油脂質量/干藻體質量）×100

1.2.8 微藻油脂產率的計算。單位時間的油脂產率（mg/（L·d））可由下式計算[13]：

油脂產率=干藻體質量×油脂含量/培養時間

2 結果與分析

2.1 微藻的生長曲線

根據所測數據，A組（PCC-7806）初始藻密度約為3.32×106個/mL，B組（PCC-7820）初始藻密度約為2.12×106個/mL，C組（FACHB-469）初始藻密度約為3.51×106個/mL，D組（FACHB-5）初始藻密度約為2.88×106個/mL?？芍谧畛跖囵B時C組的藻數量最多，其次是A組，接著是D組，而數量最少的則是B組。根據數據繪制出如下4種微囊藻生長曲線圖（圖1）。

圖1 4種微藻生長曲線

由圖1可知，在最初的幾天培養過程中，這4種藻類均是呈指數生長的趨勢，在第5天之前，這4種藻的數量關系仍保持著C組最多，B組最少的關系。在第5天的時候，B組藻的數量超過了D組藻的數量，但這2種藻的數量仍均小于A組和C組的數量，C組仍是最多的。到了第7天，A、B、C組達到了藻數量的最大值，A組藻數量最多，C組次之，其次是D組，最后是B組。到第9天，D組藻的數量達到了最大值，且其最大值大于A組在第7天時的最大值。在之后的幾天里，4種藻類的數量均呈現出下降趨勢，在第15天時，最終測出A組藻密度約為47.12×106個/mL，B組藻密度約為38.66×106個/mL，C組藻密度約為42.93×106個/mL，D組藻密度約為61.52×106個/mL。

最終是D組藻的數量最多，其余依次是A組、C組、B組。

2.2 微藻氮磷濃度變化情況

根據所測數據制作出如下4種微囊藻在尾水中氨氮、總磷濃度變化表。如表1、表2所示。

表1 4種微藻在尾水中氨氮濃度變化 單位：mg/L

表2 4種微藻在尾水中總磷濃度變化 單位：mg/L

由表1可以看出，4種微藻在最初時氨氮濃度相等，均為2.41 mg/L。在第3天的時候B組消耗的氨氮最多，其次是A組和C組，最后是D組。到達第5天時，D組的消耗超過了B組和C組，僅次于A組。在接下來的幾天中，水中氨氮含量持續下降，但下降趨勢明顯緩慢于前7天，且逐漸趨于平緩。最終在第15天時，水中氨氮含量最多的是B組，接著是C組，其次是A組，最后是D組，也就是說D組消耗的氨氮最多，B組消耗的氨氮含量最少。具體變化趨勢見圖2。

圖2 4種微藻在尾水中氨氮濃度變化

由表2可以看出，4種微囊藻在最初時總磷濃度相等，均為8.12 mg/L。在第3天的時候可知D組消耗的磷最多，其次是C組和A組，最后是B組。到達第5天時，A組的消耗超過了C組，僅次于D組。在接下來的幾天中，水中磷的含量持續下降，下降趨勢總體上較為接近，并無很明顯的波動，最終在第15天時，水中磷含量最多的是B組，接著是C組，其次是A組，最后是D組，可知D組消耗的磷最多，B組消耗的磷含量最少。具體變化趨勢可見圖3。

圖3 4種微藻在尾水中總磷濃度變化

2.3 微藻生長速率、生物量以及油脂含量的分析

藻種的生物量以及油脂含量是分析藻種產油高低的重要指標，在相同的培養條件下，藻種的生物量與油脂含量并非呈正相關的趨勢。離心收集100 mL藻液得到的濕藻體，通過冷凍干燥、研磨的干藻利用乙醇法提取其油脂，每組數據平行測定5次求其平均，得到其油脂含量。藻種生長速率、生物量和油脂含量的比較結果如表3所示。

表3 4種微藻的比生長速率、生物量以及油脂含量的比較

由表3可知，比生長速率最高的藻種是A組PCC-7806，為0.60 d-1。其次是D組和B組，分別為0.57 d-1和0.53 d-1。最低的則是C組，為0.52 d-1，所有藻種的比生長速率都大于0.5 d-1。4種微藻的生物量在1.04～2.27 g/L，其中最大的是A組，為2.27 g/L，其他藻種的生物量從大到小依次為D組1.39 g/L，B組1.13 g/L，C組1.04 g/L。

通過比較比生長速率與生物量的數據可知，生長速率高的藻種，生物量也高。因此，比生長速率最快的是A組，而它的生物量也是最高的。其他依次為D組、B組，而比生長速率最慢的是C組，它的生物量也是最低的。由此可見，它們的生物量都與比生長速率成正比。

而在相同培養條件下各個藻種油脂的含量累積都不同，即使是相同屬的藻種也不一樣。由表3可知，4種微藻的油脂含量最高的是D組，為28.07%，比最低的A組油脂含量9.95%高出了18.12個百分點。而C組和B組的油脂含量也較高，分別為27.31%和16.15%。

通過比較生物量以及油脂含量的數據可以發現：在培養藻種的過程當中，A組的生物量最高，是最低的C組的2.18倍，油脂含量卻是最低的，僅有9.95%。而生物量最低的C組，油脂含量卻很高，達到了27.31%，與油脂含量最高的D組僅相差0.76%。此現象表明僅從藻種的生物量與油脂含量來判斷4種藻種油脂累積的情況還不夠，需要引進綜合指數更高的油脂產率，才能更好地對藻種的產油情況進行評價。

2.4 微藻產油潛力評價

評價微藻的產油潛力，微藻的油脂產率是很重要的一個性能指標，它是微藻的生長情況、生物產率與油脂含量的綜合反映。為此觀察4種微藻在培養時間為15 d的油脂積累情況，4種微藻油脂產率的比較結果如圖4所示。

圖4 4種微藻的油脂產率比較

由圖4可知，D組油脂產率最高，為27.79 mg（/L·d）。A組和C組也有較高的油脂產率，分別為16.14 mg（/L·d）和20.29 mg（/L·d），最低的是B組，只有13.07 mg（/L·d）。由此可知，D組FACHB-5最適合作產油藻的候選藻種，研究價值較高。

3 結論

（1）選取4種微藻，考察其在污水廠尾水的培養條件下的生長情況、對氨氮和磷的去除效果進行研究，結果表明：D組蛋白核小球藻的密度最大，生長速率最快，其余依次是A組PCC-7806、C組FACHB-469，最小的是B組PCC-7820。4種藻類在污水中對TN的去除效果一般，對TP的去除比較理想，其中蛋白核小球藻對磷的去除率是最高的，達到了87.1%，這也與藻種在污水中的生長速率一致。由此可見，此藻種對于污水的耐受性較高，采用污水廠尾水培養藻類以治理市政污水的方法可行。

（2）4種藻類中，蛋白核小球藻的油脂含量是最高的，達到了28.07%。而根據其余藻類的生物量和油脂含量分析：微藻的生物量高，油脂含量卻不高。例如A組PCC-7806的生物量最高，是生物量最低的C組FACHB-469的2.18倍，而它的油脂含量卻是最低的，僅有9.95%。而生物量最低的C組FACHB-469，油脂含量卻很高，達到了27.31%。最后由4種藻的油脂產率來看，D組蛋白核小球藻的油脂產率最高，達到了27.79 mg/（L·d）。其余油脂產率從高到低依次為20.29、16.14、13.07 mg/（L·d）。

（3）綜合研究所得的各項指標來分析，蛋白核小球藻（FACHB-5）的生長情況、對于污水的處理效果以及油脂含量與產率均最好。因此，可選其為優勢藻種，對其優化培養條件以期為生產市政污水處理的新能源作原料。

4 展望

在全球經濟高速發展的今天，水污染、能源嚴重短缺等問題越來越突出，開發可持續的綠色能源成為當前解決這些問題的重要途經。由于微藻產油的效率高、含量高等優點，產油微藻成為了當前比較理想的生物質原料。但目前發展微藻產油還存在著許多難題，例如微藻培養的成本過高效率低下、微藻回收的成本過高等問題[14-15]。由此可見，如將產油微藻的培養和市政污水處理相耦合，不僅可以降低微藻培養的成本過高問題，還可以實現污水的治理和回收再利用；再通過研究新的光生物反應器，可以更好地優化產油微藻的培養條件，提高培養效率，增加微藻的生物量；針對微藻的回收問題，還可以深入研究更好地回收方法，對后續的回收再利用具有重要意義。將以上方面深入研究，可以促進微藻低成本高效率的培養與回收，推動微藻制油的產業化發展，為全球的能源短缺以及環境污染等問題貢獻力量。