酵母表達系統(tǒng)制備的豬圓環(huán)亞單位疫苗效果評估

段進坤，陳爽，劉濤，趙玉龍*

（1.天津瑞普生物技術股份有限公司 天津 300308；2.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司 河北保定 071000；3.河北省獸用生物制品技術創(chuàng)新中心 河北保定 071000）

豬圓環(huán)病毒是目前已知的最小動物病毒之一，基因組大小僅約1.7kb，屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，單股環(huán)狀DNA 病毒[1]。PCV目前可分為3 個基因型：PCV1、PCV2 和PCV3。其中PCV1 不具有致病性，廣泛存在于豬源細胞培養(yǎng)物中；PCV3 是最近剛在美國發(fā)現(xiàn)的一種新的基因型，可引起心臟和多系統(tǒng)炎癥；PCV2 致病性最強，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（PMWS）等一系列圓環(huán)病毒病（PCVD）的病原[2]，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。

接種疫苗預防PCV2 發(fā)生是防控疾病的有效方法。PCV2 商品化疫苗主要包括全病毒和PCV1-2 嵌合病毒滅活疫苗和Cap 亞單位疫苗[3]。PCV2 病毒較難培養(yǎng)，主要在PK15 細胞系中感染擴增，病毒滴度低，培養(yǎng)成本高[4]，全病毒滅活疫苗常存在病毒含量偏低，免疫效果不盡理想。而通過現(xiàn)代生物學技術體外表達cap 蛋白，可在短時間內獲得大量、廉價的cap 蛋白。不同于一般的亞單位疫苗，體外表達的PCV2 cap 蛋白可自我組裝成類病毒顆粒（VLPs），免疫原性強，生物安全性高，免疫效果要優(yōu)于全病毒滅活疫苗。PCV2 cap 蛋白已經在多種表達系統(tǒng)中成功表達，如昆蟲-桿狀病毒、哺乳動物細胞、大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌等[5-9]。其中，利用馬克斯克魯維酵母（kluyveromyces marxianus，KM）系統(tǒng)的表達水平最高，可高達2g/L[10]。

酵母表達系統(tǒng)因其表達水平高，易培養(yǎng)，外源蛋白活性高，無內毒素殘留等優(yōu)勢，在生物醫(yī)藥和酶制劑等領域被廣泛使用。馬克斯克魯維酵母是一種安全、可食用的酵母，已得到歐盟和美國FDA的食品安全認證，中國衛(wèi)生計生委批準了馬克斯克魯維酵母作為新食品原料。馬克斯克魯維酵母還具有生長快速、耐溫、碳源利用譜系廣，分泌表達能力強、外源蛋白表達量高等優(yōu)點。因此，馬克斯克魯維酵母在基因工程疫苗、工業(yè)酶等外源蛋白的制備方面具有良好的工業(yè)應用潛力。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物

表達PCV2 cap 的重組馬克斯克魯維酵母（KM-PCV2）由復旦大學提供；配制圓環(huán)疫苗所需的IMS1313 佐劑購自SEPPIC 公司；圓環(huán)競品疫苗為某進口圓環(huán)疫苗產品；14～20 日齡PCV2 抗原和抗體雙陰性仔豬購自秦皇島某豬場；豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA 抗體檢測試劑盒購自北京金諾百泰生物技術有限公司。

1.2 KM-PCV2 重組酵母菌高密度發(fā)酵

挑取KM-PCV2 新鮮克隆，接種于200mL YD 培養(yǎng)基中。30℃，220rpm 培養(yǎng)18～24h，制備一級種子。一級種子按照1:10 的稀釋比例接種到2L 含有葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂等成份的合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm 培養(yǎng)16～18h，制備二級種子。二級種子按1:20 比例接種到含30L 底料的100L 發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中通風并攪拌，補料采用全料流加方式，溶解氧控制在20%～30%，控制溫度在30℃，pH 值在5.5 左右，每隔6h 取樣測定菌體密度，發(fā)酵時間為60h。

1.3 KM-PCV2 重組cap 蛋白純化

發(fā)酵液離心后收集菌體，先用PBS 重懸清洗兩遍，然后用結合緩沖液（20mM 磷酸鈉、100mM 氯化鈉、0.01%吐溫80；pH 6.8）重懸菌體至100 OD600，使用低溫高壓均質機破菌（1,800br，2 次）。破菌液經12,000rpm 轉速離心30min，收集上清。加入等體積的結合緩沖液后將pH 值調節(jié)至6.8，用于后期純化。

取100mL 陽離子交換樹脂填充到層析柱中，先用超純水沖洗1h，然后用結合緩沖液沖洗10 倍柱體積。取400mL 制備好的上樣液按10mL/min 的流速上樣。上樣結束后先用結合緩沖液沖洗約3倍柱體積，然后用120mL 洗脫緩沖液洗脫（含1M 氯化鈉的結合緩沖液）目的蛋白。洗脫液經300kD 膜包超濾置換后保存于4℃冰箱，用于下一步配苗。

1.4 PCV2 亞單位疫苗配制

先用生理鹽水將PCV2 cap 蛋白溶液稀釋至120μg/mL，然后按1:1 體積比加入IMS1313 佐劑，混合均勻。

1.5 仔豬免疫實驗

從養(yǎng)殖場篩選3～4 周齡圓環(huán)抗原抗體雙陰性健康仔豬15 頭，平均為分為3 組。第一組為對照組，不免疫；第二組為商品疫苗免疫組，頸部肌肉注射1mL 競品圓環(huán)疫苗；第三組為實驗組，頸部肌肉注射1mL 酵母源圓環(huán)疫苗。免疫后2 周、3 周、4 周和5 周采血分離血清，使用商品化ELISA 試劑盒檢測PCV2 抗體效價。

2 結果

2.1 KM-PCV2 高密度發(fā)酵

采用無機鹽合成培養(yǎng)基進行重組酵母菌的高密度發(fā)酵，60h 菌體濃度可達到500g/L。發(fā)酵過程中菌體的生產情況見圖1。

圖1 KM-PCV2 重組酵母菌高密度發(fā)酵

2.2 PCV2 cap 蛋白純化

重組酵母發(fā)酵液經破菌，離心，層析，超濾等純化流程后，得到高純度的圓環(huán)蛋白溶液，蛋白純度達到95%以上（圖2）。通過電鏡觀察，純化的PCV2 cap 蛋白能高效組裝成病毒樣顆粒（圖3）。

圖2 PCV2 cap 蛋白純化

圖3 VLP 電鏡觀察

2.3 仔豬免疫實驗

免疫3～4 周齡的圓環(huán)抗原抗體雙陰性仔豬，免疫后的2～5 周，血清中特異性的圓環(huán)抗體滴度逐漸升高，且酵母源圓環(huán)疫苗的抗體水平要高于競品圓環(huán)疫苗組（圖4）。

圖4 免疫仔豬血清中的圓環(huán)抗體檢測

3 討論

圓環(huán)亞單位疫苗出色的免疫保護效果已經得到了市場的充分驗證，但現(xiàn)有的圓環(huán)cap 蛋白主要是由昆蟲-桿狀病毒系統(tǒng)表達制備，因生產成本高、蛋白表達水平低、生產過程繁瑣等因素限制，無法大規(guī)模推廣應用。應用我國自主知識產權的KM 酵母表達系統(tǒng)表達PCV2 cap 蛋白，蛋白表達水平高于昆蟲-桿狀系統(tǒng)近20 倍，且生產工藝簡單，生產成本低。

由KM 酵母表達的PCV2 cap 蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒，前期研究已驗證了KM 酵母源PCV2 亞單位疫苗能在小鼠中刺激產生高水平的血清IgG 抗體，攻毒后能顯著降低脾臟和肺臟中的病毒含量。在此研究中，我們在仔豬上驗證了疫苗的免疫效果。說明KM 酵母源PCV2 亞單位疫苗是一款安全、有效且成本可控的良好動物疫苗。

酵母細胞壁較厚且堅硬，不易破碎。現(xiàn)有工藝利用高壓均質機破碎酵母，效率不高，且破菌過程中會產生大量的微小顆粒，造成樣品濁度高，不利于后期澄清及純化。因此后期需要對菌體裂解工藝進行深入研究，或對重組酵母菌進行遺傳改造，實現(xiàn)外源蛋白的高效分泌表達。