三種檢測方法在翠屏區牛結核病檢疫中的應用

潘延樂，陳銘，王穎旺

（1.宜賓市翠屏區動物疫病預防控制中心 四川宜賓 644000；2.河南省信陽市動物疫病預防控制中心 河南信陽 464000）

牛結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染病，其病原菌可以廣泛傳播于人與牛之間，是重要的人畜共患病之一。世界動物衛生組織（WOAH）把該病列為B 類傳染病，我國將其列為二類動物疫病[1]。該病是目前牛的重要傳染病之一，嚴重危害奶牛養殖。感染譜較廣，其中奶牛最易感，黃牛和耗牛次之，豬、鹿、猴、人均可感染。牛結核病根據感染靶器官的不同分為腸結核、肺結核、淋巴結核和乳腺結核四類，不同類型的結核病有不同的危害。其主要病理特征為各種組織器官出現肉芽腫脹、嚴重時出現干酪樣壞死，甚至鈣化。結核分枝桿菌根據病原菌的不同分為牛型、人型和禽型，且不同類型對靶動物的親近性較強，而各種類型之間存在交叉感染。

在我國，牛結核病對奶牛養殖場的感染率較高，感染區域范圍廣，在我國大部分地區均有本病的報道[2]。發病無明顯季節性，常年可發病，尤其是氣候干燥、氣溫寒冷的冬天高發。牛結核分支桿菌屬于胞內寄生菌，一般的抗生素對其無效，奶牛一旦感染，即使不發病也會終身帶毒。這給奶農帶來困擾，結核病能通過水源、飼料、空氣、塵埃、痰液等直接或間接傳播，也可以通過皮膚、唾液、注射器、刀具等接觸傳播，傳播方式多樣性給牛結核病凈化帶來很多現實困難。

牛結核病的診斷主要依據臨床癥狀和流行病學特點來初步診斷，加以實驗室確診。實驗室檢測技術主要包括細菌分離鑒定、免疫學方法和分子生物學方法等[3]。這些檢測方法各有優缺點，在牛結核病檢疫和凈化過程中需要根據實際情況選擇合適的檢測方法進行檢測。

國外常用皮內變態反應和γ-干擾素體外釋放試驗進行檢疫[4]，1990 年Wood 等[5]通過檢測牛結核菌素刺激牛全血釋放的γ-干擾素，闡明了診斷牛結核病的ELISA 方法。γ-干擾素（interferon gamma，IFN-γ）是活化的T 淋巴細胞和NK 細胞在特定抗原和絲裂原的刺激下產生的廣譜抗腫瘤、抗病毒、抑制細胞增殖和免疫調節糖蛋白。γ-干擾素ELISA 試驗和皮內變態反應是國家標準GB/T 18645—2020 中規定的牛結核病檢測方法[6]，也是世界動物衛生組織規定的國際貿易制定使用的檢測方法，翠屏區對轄區內的57 頭奶牛分別用皮內變態反應試驗、膠體金快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 試驗進行了比對試驗。

1 牛結核分枝桿菌皮內變態反應試驗

1.1 試驗材料

翠屏區轄區內的181 頭奶牛信息見表1，本文中的奶牛養殖戶用字母代替；提純牛型結核菌素凍干粉PPD（BoPPD）購自中牧實業有限公司，批號為1908001，使用前按照說明書要求稀釋；碘伏、注射器、刮毛刀、游標卡尺、保定繩等。

表1 翠屏區2022年牛結核病普查養殖戶存欄量信息表

1.2 試驗方法

在牛頸側身中部偏上1/3 處將毛剃干凈，直徑約為10cm，用游標卡尺測量術部中央皮皺厚度，此為原始皮厚，做好原始記錄。術部消毒后，注射稀釋好的牛PDD 0.1mL；注射后局部會出現小皰；72h 后仔細觀察局部有無腫脹、熱痛等炎性反應，用游標卡尺測量皮皺厚度作為反應皮厚，并做好記錄。

1.3 結果判定

計算出每頭牛的皮厚差（皮厚差=反應后皮厚-初始皮厚）。陰性反應：皮厚差小于2.0mm，無炎性反應；陽性反應：皮厚差大于或等于4.0mm，局部有炎癥反應；可疑反應：皮厚差大于或等于2.0mm但小于4.0mm，局部炎性反應不明顯。

2 牛結核分枝桿菌γ-干擾素ELISA 試驗

2.1 試驗材料及儀器設備

用含有肝素鈉的真空采血管進行無菌采血，采集上述牛全血樣品每頭約5mL，共57 份；牛結核病γ-干擾素ELISA 檢測試劑盒，來源于武漢科前生物股份有限公司，試劑批號為20 220301；移液器、U形離心管、生物安全柜、37°C 恒溫培養箱、酶標儀、洗板機等。

2.2 試驗方法

1）全血采集及預處理。抗凝血需在5h 內送到實驗室，避免冷凍。并對血樣編號，將試管緩慢顛倒充分混勻血液樣品進行分裝。在無菌條件下將抗凝血分別加入U 形離心管，每份血樣加3 孔，500μL/孔。

2）加入刺激抗原。在無菌條件下分別向相應的U 型管中加入100μL PBS、100μL 牛PPD、100μL 禽PPD，為保證抗原與血液充分混合，在微量振蕩器上輕微振蕩1min 左右。將U 形管置于37°C 恒溫培養箱中培養16～24h。

3）收取上清液。孵育結束，將U 形離心管置于離心機中，2,000rpm離心5min，之后用移液器從每孔吸取約100μL 上清液轉入96 孔包被板中。

4）牛γ-干擾素ELISA 試驗。將其他相關試劑進行室溫平衡。按照樣本布局表加入獲取的上清樣本100μL/孔；同時設陰性對照和陽性對照各2 孔，37℃孵育45min。洗滌：倒掉孔內液體，每孔加入300μL 工作濃度的洗滌液，重復洗滌4 次，最后一次在吸水材料上拍干。加入酶標結合物：每孔加入100μL 兔抗牛γ-干擾素多克隆抗體，37℃孵育30min。洗滌：如上洗滌4 次。加入底物：每孔依次加入50μL 底物A 溶液和50μL 底物B 溶液，震蕩混勻，于室溫（20～25℃）下避光顯色10min。加入終止液：每孔加入50μL 終止液，輕輕震蕩混勻，10min 內在酶標儀上測量各孔OD630nm值。

5）結果判定：陽性對照OD630nm平均值≥0.5，陰性對照OD630nm＜0.3，試驗成立。計算各樣品的OD 值，陽性：牛PPD 的OD 值-禽PPD 的OD 值≥0.2 且禽PPD 的OD 值-陰性抗原OD 值≥0.2，其他情形均判為牛結核病陰性。

3 膠體金檢測方法

3.1 試驗材料及方法

布魯氏菌抗體快速檢測卡來源于上海快靈生物科技有限公司，批號為G220601310，全血樣品為步驟2 中的抗凝全血。吸管吸取全血，將1 滴全血樣品滴入稀釋管中，輕輕吸混勻，用吸管吸取檢測液，在加樣孔上方垂直滴加2 滴。45s 內測試窗口無液體移行，需追加1 滴檢測液。室溫條件下靜置5min 觀察結果，超出10min的結果無效。

3.2 判定標準

在檢測試紙條上C 線和T 線均出現色帶為布魯氏菌抗體陰性，試紙條上C 線顯示紅色顏色條帶，為布魯氏菌抗體陽性，在檢測試紙條上C 線不顯示色帶，無論T 線是否顯示紅色色帶，均判為無效結果。

4 試驗結果

4.1 檢測陽性率的比較分析

用皮內變態反應試驗對57 頭奶牛進行檢測，出現8 頭陽性奶牛，個體陽性率為14.03%（8/57），對57 頭奶牛全血進行刺激培養和γ-干擾素ELISA 試驗進行檢測，結果顯示γ-干擾素ELISA 方法檢出陽性樣品1 份，陽性率為1.75%（1/57），膠體金快速檢測卡試驗陽性率為29.82%，見表2。

表2 不同方法檢測陽性率統計結果

4.2 皮內變態反應與γ-干擾素ELISA 檢測方法比較結果

對57 份樣品用γ-干擾素ELISA 檢測與皮內變態反應方法進行比對，結果表明：皮內變態反應試驗檢出陽性8 頭，γ-干擾素ELISA 方法檢出陽性1 頭，兩種方法檢出的雙陽性牛為1 頭，雙陰性牛為49 頭，兩者之間的敏感性為100%（1/1），特異性為87.5%（49/57），符合率為87.72%（50/57）（表3）。

表3 皮內變態反應與γ-干擾素ELISA方法檢測比較結果

4.3 三種不同的方法結果的比較

用三種不同的方法對翠屏區57 頭奶牛進行牛結核病檢測，結果如表4，用皮內變態反應對57 頭奶牛進行初篩，對檢測陽性和可疑奶牛經過膠體金快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 試驗復檢，確診1 頭牛為結核病陽性牛。

表4 三種方法牛結核病檢測結果

根據表中結果統計，三種方法均為陽性的有1 頭，均為陰性的有42 頭，總符合率為75.44%（43/57）。γ-干擾素ELISA 方法與PPD相比，牛結核菌素均為陽性的為1 頭，陽性符合率為12.5%（1/8）。膠體金檢測與PPD 相比，均為陽性的6 頭，陽性符合率為75%（6/8），陰性符合率為83.67%（41/49），說明膠體金檢測方法特異性較強，可以用于引種時的快速檢疫。γ-干擾素ELISA 方法與膠體金檢測相比，均為陽性的1 頭，陽性符合率為16.67%（1/6）。

5 討論

5.1 牛結核分枝桿菌皮內變態反應試驗

181 頭牛中對57 頭奶牛進行了皮內變態反應試驗，這并不排除181 頭奶牛中剩余的124 頭奶牛沒有牛型結核分枝桿菌或禽型結核分枝桿菌或兩者兼而有之的可能性，早期感染結核病的奶牛在3～6 周后才能出現變態反應，這可能會導致皮內變態結果是陰性或可疑結果[7]；也可能遲發型超敏反應對慢性感染動物的敏感性低，結核菌素試驗會產生假陰性結果。因此，上述牛并不能完全排除早期感染或慢性感染的可能性，僅依靠結核菌素皮內變態反應試驗來根除牛群中的結核病是不科學的。

5.2 膠體金快速檢測卡

膠體金快速檢測卡是檢測感染牛血清或血漿中結核分枝桿菌產生的抗體，從而顯示出視覺可判定的結果。這種方法操作簡便，敏感性和特異性高，時效性強，適合基層檢疫工作使用，但缺點是試劑盒較貴，檢測成本高。

5.3 γ-干擾素ELISA 抗體試驗

三種方法均為評價細胞免疫功能的試驗[8]，通過不同型的PPD刺激紅細胞產生γ-干擾素進行判定，可以排除禽分枝軒菌對牛引起的非特異性反應。本試驗中皮內變態反應試驗陽性檢出率高于膠體金快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 試驗，很可能與結核菌素皮內變態反應存在假陽性有關。

5.4 γ-干擾素ELISA 試驗相對優勢

牛PPD 試驗在實際操作過程中，存在許多不確定性和主觀因素，結果判定不易標準化，比較繁瑣費時，需要術后72h 才能觀察結果，導致在診斷過程中出現系統性誤差的可能性較大，但其價格最低、操作簡便，適用于大規模的監測。γ-干擾素ELISA 試驗只需保定一次動物，省時省力，可檢測出早期感染結核病的牛，并且判定標準為可量化的數據，實驗結果科學客觀。同時，γ-干擾素ELISA 試驗還克服了結核菌素皮內變態反應容易出現假陽性和假陰性的不足，提高了試驗的特異性[9]。

目前，國外許多國家如英國、歐盟等，在牛結核病防治計劃中使用γ-干擾素試驗增強特異性，兩種試驗并行進行，可增強敏感性，最大程度檢測感染動物，消除假陽性牛，現正被農業部確定為牛結核病監測工作中的可靠方法，具有廣闊的應用前景。

6 結論

精準的診斷出感染牛結核分枝桿菌，對牛結核病的控制和凈化至關重要。從本試驗的結果來看，若單獨使用皮內變態反應檢出的PDD 陽性牛就進行撲殺，必然造成假陽性牛被誤殺，給養殖戶造成巨大損失。

隨著人類社會的發展，人們對奶制品的安全要求越來越高，在引進奶牛的同時也容易把疫病帶入，帶病牛持續排毒，污染環境，感染健康的奶牛，造成惡性循環，針對這種情況，翠屏區在2000 年左右就開始牛結核病監測，并且對每年檢出的陽性牛進行了無害化處理，持續不斷地監測，讓翠屏區的奶牛結核病處于相對安全的狀態，但以往的監測復查均采用的是牛型結核菌素皮內變態反應方法，假陽性和假陰性檢出率較高，本次試驗在省級有關部門的指導下做了皮內變態反應、快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 抗體對比試驗。通過本試驗，認為牛結核菌素試驗適合大規模初篩，快速檢測卡適用于引種快速檢疫，而要進一步確診還需要用γ-干擾素ELISA 抗體檢測方法。

要想徹底凈化奶牛結核病，須得做到以下幾點：①嚴懲非法引種，對非法從疫區引種的人員進行嚴懲；②嚴格落實引進檢疫政策，禁止引進免疫區和有疫病史的牛，強化落地檢疫政策，倡導自繁自養；③定期開展結核病篩查，對監測陽性牛，立即組織撲殺，并且按照《病死及病害動物無害化處理技術規范》做無害化處理；④養殖場（戶）要嚴格實施生物安全措施，防止外界致病菌進入到養殖場，對從外部引入的牛，要嚴格做好隔離檢疫工作。