復方祖師麻凝膠貼提取工藝及基質處方優化研究

呂志陽，陳 靜，薛 原，張曉蝶，楊佳雯，湯春艷，陳 璟，顧雪梅，楊雨微

（南京中醫藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300）

祖師麻為瑞香科植物黃瑞香、陜甘瑞香、凹葉瑞香的莖皮和根皮，是西北民間常用藥，用于治療風濕痹痛、活血止痛、四肢麻木、跌打損傷、風濕性關節炎等［1-2］，瑞香素是其發揮鎮痛、抗炎功效的主要成分。由于祖師麻有小毒，故大多外用，上市制劑主要為貼劑和軟膏，但在應用過程中會有皮膚刺激性，常表現為丘疹等不良反應。有研究采用甘草配伍，可緩解祖師麻毒性和刺激性；課題組前期也發現，甘草配伍祖師麻后，后者抗炎、鎮痛效果更好［3］。

復方祖師麻制劑由祖師麻、石菖蒲、梔子、甘草4 味中藥組成，其中軟膏劑型外用效果較好，但存在劑量不易控制、使用不便等問題。本實驗以方中君藥祖師麻主要成分瑞香素為評價指標，采用Box-Behnken 響應面法優化提取工藝，并選擇高分子材料聚丙烯酸鈉NP-700 作為骨架結構，正交試驗優化基質處方，再篩選透皮吸收促進劑，最終制得性質優良的復方祖師麻凝膠貼劑，可為后續相關開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（型號Agilent 1260，美國安捷倫公司）；電子天平（型號Yiii407102，上海菁海儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（型號HHS，金壇市醫療儀器廠）；超聲波清洗儀（型號KH-500B，昆山禾創超聲儀器有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；藥物透皮擴散試驗儀（型號RYJ-12B，上海黃海藥檢儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 祖師麻（甘肅泰康制藥有限責任公司，批號 110900-201006）；甘草（批號200305）、石菖蒲（批號200915）、梔子（批號200822），均購自南通三越中藥飲片有限公司，均經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定為正品。瑞香素對照品（成都鈉鈳鋰生物科技有限公司，批號nkl20090207）；瑞香素原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號B21084）。

無水乙醇（批號10009218，國藥集團化學試劑有限公司）；生理鹽水（批號191227-10C，江蘇淮安雙鶴藥業有限責任公司）；氮酮［批號59227-89-3，阿拉丁試劑（上海）有限公司］；聚丙烯酸鈉NP-700（批號9Z1470A，廣州佳樹化工有限公司）；丙三醇（批號20141201，廣東光華科技股份有限公司）；甘氨酸鋁（批號13682-92-3，上海麥克林生化科技有限公司）；酒石酸（批號526-83-0，上海麥克林生化科技有限公司）。無紡布膏藥貼布（批號20210317X，河北省榮軒浩宇有限公司）。

1.3 動物 ICR 小鼠，雄性，體質量（20±2）g，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，動物使用許可證號SYXK（浙）2014-001。

2 方法與結果

2.1 瑞香素含量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.5% 磷酸（48∶52）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長327 nm；進樣量10 μL。理論塔板數按瑞香素計算，應不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的瑞香素對照品5.14 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取祖師麻30 g、甘草20 g，置于圓底燒瓶中，加入8 倍量75%乙醇回流提取2 h，濾過，旋蒸，真空干燥，超聲溶解20 min，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2.5 mL，甲醇制成系列質量濃度，分別精密吸取10 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝23.608X－38.554（R2＝0.999 9），在32.18～514 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.1.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得瑞香素峰面積RSD 為3.96%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復性試驗 精密稱取祖師麻、甘草各6 份，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得瑞香素峰面積RSD 為4.29%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.4 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，于0、1、2、4、8 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得瑞香素峰面積RSD 為0.25%，表明溶液在8 h 內穩定性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取祖師麻、甘草各6 份，加入約20 mg 瑞香素對照品，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，瑞香素平均加樣回收率為98.21%，RSD 為4.66%。

2.2 出膏率測定 取供試品溶液35 mL 至已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，在60 ℃下干燥45 min后置于干燥器中，冷卻30 min，精密稱定質量，計算出膏率，公式為出膏率＝（干膏質量／藥材總質量）×100%。

2.3 提取工藝優化 參考預實驗結果，選擇乙醇體積分數（A，60%～80%）、乙醇用量（B，6～8倍）、提取時間（C，1～2 h）作為影響因素，瑞香素含量、浸膏得率綜合評分Y（Y＝瑞香素含量×0.5＋浸膏得率×0.5）作為評價指標，采用Design-Expert 8.06 軟件進行Box-Behnken 響應面設計，優化提取工藝，因素水平見表1，結果見表2。

表1 Box-Behnken 響應面法因素水平Tab.1 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表2 Box-Behnken 響應面法設計與結果Tab.2 Design and results of Box-Behnken response surface method

再采用Design-Expert 8.06 軟件對表2 數據進行二次多項回歸擬合，得方程為Y＝7.04－0.093A＋0.28B＋0.28C－ 0.054AB－ 0.19AC＋0.015BC－0.29A2－0.29B2＋0.12C2，方差分析見表3。由此可知，模型F＝5.18，P＜0.05，表明具有高度顯著性；失擬項P＝0.198 6＞0.05，表明未知因素對結果影響較小，擬合度良好；一次項A、B無顯著影響（P＞0.05），C有顯著影響（P＜0.05），影響程度依次為C＞B＞A；各交互項、二次項均無顯著影響（P＞0.05）；模型R2＝0.869 4，表明含量測定值與預測值之間的一致性良好；變異系數（CV）＝3.17%＜5%，校正系數，表明模型可靠，可用于分析預測［4］。

表3 Box-Behnken 響應面法方差分析Tab.3 Analysis of variance for Box-Behnken response surface method

響應面分析見圖1。由此可知，固定提取時間不變時，乙醇體積分數曲線變化趨勢比乙醇用量更明顯，但前者超過70% 后開始下降，可能原因為其過高時會導致部分瑞香素被破壞，使得含量降低，同時溶出其他成分，出膏率隨之減少；固定乙醇用量不變時，乙醇體積分數越低，提取時間越長，綜合評分越高，并且提取2 h 時最高；各因素影響程度依次為C＞A＞B。

圖1 各因素響應面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

最終確定，最優提取工藝為乙醇體積分數65%，乙醇用量8 倍，提取時間2 h，綜合評分為7.489。按上述優化工藝進行3 批驗證試驗，測得綜合評分為7.851，與預測值7.489 接近（偏差小于5%），表明模型擬合效果良好。

2.4 基質處方優化

2.4.1 凝膠貼制備 取2.5 g 聚丙烯酸鈉、17.5 g丙三醇，置于同一燒杯中，室溫溶脹2 h，作為A相；取提取物粗粉2 g，加入A 相混勻溶解，作為B 相；取0.1 g 酒石酸加水溶解，再加入0.1 g 甘氨酸鋁，混合均勻［5］，作為C 相，將C 相倒入B相中，在磁力攪拌器上300 r／min 攪拌3 min，隨后迅速均勻涂在無紡布上，厚度約1.5 mm，室溫固化24 h，蓋上背襯層，即得［6］。

2.4.2 評價指標測定 以綜合感官得分（涂展性、均勻性、皮膚追隨性、殘留性）及初黏力的總分為評價指標，其中綜合感官每項指標最高15分，初黏力40 分，滿分100 分，評分標準［7-9］見表4。采用2020 年版《中國藥典》 四部通則0952 項黏附力測定法（第一法，即滾球斜坡停止法）測定初黏力，將凝膠貼在溫度18～25 ℃、相對濕度40%～70%下靜置2 h 后固定于傾斜板上，上端位于傾斜板水平線的下線位置，黏性面向上，沿斜面方向的貼劑長度不超過5 cm，需完整貼合，鋼球放在水平線的上線位置，沿斜面自由滾下，重復3次，要求鋼球全部粘附，記錄可粘住的最大鋼球號。

表4 評分標準Tab.4 Scoring standards

2.4.3 正交試驗 預實驗發現，丙三醇用量在15～20 g 范圍內具有較好的保濕性；聚丙烯酸鈉NP-700 用量在1.5～3.5 g 范圍內較易涂布，而且具有較好的內聚力；甘氨酸鋁用量在0.05～0.15 g范圍內較易涂布；酒石酸用量在0.05～0.15 g 范圍內具有較好的黏性。因此，本實驗選擇丙三醇用量（A）、聚丙烯酸鈉NP-700 用量（B）、甘氨酸鋁用量（C）、酒石酸用量（D）作為影響因素，正交試驗優化基質處方，因素水平見表5，結果見表6～7。由此可知，各因素均有顯著影響。

表5 正交試驗因素水平Tab.5 Factors and levels for orthogonal test

表6 正交試驗設計與結果Tab.6 Design and results of orthogonal test

最終確定，最優基質處方為A2B1C2D1，即丙三醇用量17.5 g，聚丙烯酸鈉NP-700 用量1.5 g，甘氨酸鋁用量0.10 g，酒石酸用量0.05 g。

2.4.4 驗證試驗 按“2.4.3” 項下優化基質處方制備3 批樣品，計算總分［10］，結果見表8。由此可知，該工藝穩定可行，并且所得凝膠貼外觀光滑平整，無顆粒和氣泡，黏性較好。

表8 驗證試驗結果（n＝3）Tab.8 Results of verification tests（n＝3）

表7 正交試驗方差分析Tab.7 Analysis of variance for orthogonal test

2.5 促滲劑篩選 凝膠貼需加入透皮吸收促進劑以提高藥物透皮吸收效果，本實驗以瑞香素累積滲透量為指標，選擇經典輔料氮酮作為促滲劑，考察其用量在5%、3%、1%時的促滲效果［11］。

2.5.1 離體皮膚制備 將小鼠脫頸椎處死，刮凈腹部毛發后取下皮膚，去除皮下脂肪和血管，生理鹽水清洗干凈，置于－20 ℃冰箱中冷藏。透皮實驗前取出，放到37 ℃生理鹽水中自然解凍，浸泡30 min，再用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干備用［12］。

2.5.2 操作步驟 采用RYJ-12B 型藥物透皮擴散試驗儀、Franz 擴散池，設置溫度為（37±0.2）℃，透皮面積為2.2 cm2，接受池體積為6.5 mL，接受液為生理鹽水-無水乙醇（50∶50）。將小鼠離體皮膚固定于接受池上，取凝膠貼1.7 g（有效透皮面積2.2 cm2），平行6 份，在滲透擴散裝置的擴散室與接受室之間固定皮膚，外側朝向擴散室，將凝膠貼固定［13］，接收室中注入接收液，使液面完全與皮膚內層接觸，在恒溫（37 ℃）、300 r／min 下磁力攪拌，于1、2、4、6、8、12 h 各吸取2 mL透皮接收液，并補加同體積新鮮接收液，濾過，重復6 次，接受液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以單位面積累積滲透量為縱坐標，時間為橫坐標繪制累積滲透曲線，見圖2。

圖2 瑞香素累積滲透曲線（n＝6）Fig.2 Accumulative permeability curves for daphnetin（n＝6）

2.5.3 結果分析 由圖2 可知，加入氮酮后瑞香素累積滲透量明顯升高，不同用量下其促滲效果依次5%＞3%＞1%，即5%氮酮累積滲透量最高，達66.8%，與不加氮酮相比提高近3 倍，故選擇其作為透皮吸收促進劑。

3 討論

復方祖師麻制劑包含祖師麻、石菖蒲、梔子、甘草4 味藥材，本實驗在優化其提取工藝過程中選擇君藥祖師麻有效成分瑞香素作為評價指標，主要是因為石菖蒲中細辛醚類成分為揮發油，常需單獨提取后采用氣相色譜檢測；梔子中梔子苷醇得率較高；甘草酸銨在不同提取條件下含量變化不明顯。再采用Box-Behnken 法優化提取工藝，可準確預測提取結果，并且浸提效率高，提取完全。

凝膠貼劑因其使用方便、藥物吸收良好等優點，已成為經皮給藥制劑的研發熱點，但在制備過程中常出現黏附力及彈性不夠、貼敷易滑落等問題。本實驗選擇丙三醇、聚丙烯酸鈉NP-700、甘氨酸鋁、酒石酸等輔料制備復方祖師麻凝膠貼，其配比及加入順序均會影響制劑成形性，結果發現攪拌時間、速度、溫度對其性狀影響最大，故把握好攪拌方法是關鍵所在［14-16］。

復方祖師麻凝膠貼作為經皮給藥系統，藥物釋放、透皮行為是其吸收的前提條件。本實驗選擇離體動物皮膚作為對象，氮酮作為透皮吸收促進劑，發現其加入量為凝膠貼質量的5%時，12 h 內累積釋放率達66.8%。但中藥復方中氮酮用量一般不超過5%，故后續考慮采用多元促滲體系，可減少促透劑用量，也能起到更好的透皮吸收效果。同時，也可采用薄荷腦［17］、冰片［18］等中藥揮發性成分作為透皮吸收促進劑，既可體現中藥制劑“藥輔合一” 理念，也可減少輔料用量，提高安全性。