一測多評法同時測定沙芪濃縮丸中5 種黃酮

薩出拉，王秀枝，楊立國包書茵*，奧烏力吉*

（1.內蒙古民族大學，內蒙古 通遼 028000； 2.內蒙古自治區蒙醫藥研究所，內蒙古 呼和浩特 010020；3.通遼職業學院，內蒙古 通遼 028000）

蒙藥沙芪濃縮丸中君藥沙蓬是藜科植物沙蓬Agriophyllum squarrosum（L.）Moq.的干燥地上部分，為蒙古族習用藥材，蒙文名楚力格日，具有祛疫、清熱、解毒、利尿等功能［1-2］，用于治療“疫熱增盛，身目黃疸，尿道灼痛，腎熱”［3-4］。沙蓬種子是藥食同源物，迄今已中分離得到黃酮、三萜皂苷、生物堿、酚苷等化合物［5-7］，研究表明，其皮中的黃酮類成分蘆丁、異槲皮苷、異葒草素具有較強的清除自由基DPPH 的能力［8］；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠具有顯著降血糖活性，并且水提物、醇提物可顯著降低糖尿病大鼠血糖、血脂，改善糖耐量［9-11］，另外該藥材對糖尿病肝損傷也有良好的抑制作用［12-13］。目前，正逐步研發沙蓬與不同藥物配伍而具有抗氧化、抗炎、改善肝腎功能功效的新藥［14］，但尚無沙芪濃縮丸中多成分含量同時測定的報道。

王智民等［15］首次提議，采用一測多評法對中藥進行多指標質量控制，它是采用1 種易得對照品作為內標，從而實現對多成分含量同時測定的手段［16-18］。本實驗采用該方法同時測定沙芪濃縮丸中毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素5 種黃酮的含量，以期為該制劑質量評價提供有效參考依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies 公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ZDHW 調溫電熱套（河北中興偉業實驗儀器有限公司）；CCA-112 冷卻水循環裝置（上海愛朗儀器有限公司）；HH-2 數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；TDI0001A、YP10001 電子天平（上海佑科儀器表有限公司）；KQ-C20 玻璃儀器氣流干燥器、R-1010 旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）；UPH-I-20L 優普系列超純水器（四川優普超純科技有限公司）；LDZ4-0.8 離心機（北京醫用離心機）；DHG-9145A 鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；T-1200N 馬弗爐（鄭州天縱電器設備有限公司）；錐形瓶；蒸發皿；硅膠G 薄層板；稱量瓶；量瓶；無灰濾紙；坩堝。

1.2 試劑與藥物 沙芪濃縮丸（自制，批號202009、202105、202106）。毛蕊異黃酮苷（純度＞98%，CAS 號20633-67-4，批號B20847）、水仙苷（純度＞98%，CAS 號604-80-8，批號B2179）、異鼠李素（純度＞98%，CAS 號78-70-6，批號B21554）、銀鍛苷（純度＞98%，CAS 號20316-62-5，批號B21578）、芒柄花素（純度＞98%，CAS 號485-72-3，批號B20836）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Welch LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.4% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～15 min，15%～38% A；15～25 min，38%～42% A；25～30 min，42%～82%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，各黃酮色譜峰分離度均大于1.5。

圖1 各黃酮HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various flavonoids

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素對照品1.25、1.47、1.23、1.96、2.47 mg，25 mL 70%甲醇搖勻溶解，分別制成每1 mL 分別含各成分0.025、0.029、0.024、0.039 2、0.049 mg 的 溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過4 號篩）約1 g，加50 mL 90% 甲醇（含1% 甲酸），超聲（功率100 W，頻率40 kHz）處理60 min，濾過，取25 mL 濾液，在40～50 ℃下蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中并定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液適量，稀釋成不同質量濃度（水仙苷0.029 4、0.058 8、0.117 6、0.176 4、0.235 2、0.294 mg／mL，銀鍛苷0.024 6、0.049 2、0.098 4、0.147 6、0.196 8、0.246 mg／mL，毛蕊異黃酮苷0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg／mL，異鼠李 素0.039 2、0.078 4、0.156 8、0.235 2、0.313 6、0.392 mg／mL，芒柄花素0.049 4、0.098 8、0.197 6、0.296 4、0.395 2、0.494 mg／mL），在“2.1” 項色譜條件下各進樣10 μL 測定。以對照品峰面積（Y）對其質量濃度（X）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各黃酮線性關系Tab.1 Linear relationships of various flavonoids

2.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素峰面積 RSD 分別為 0.13%、0.17%、0.02%、0.07%、0.07%，表明儀器精密度較好。

2.4.3 穩定性試驗 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素峰面積RSD 分別為 0.86%、0.77%、0.89%、1.90%、1.10%，表明溶液在12 h 內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一批本品粉末（批號202009）0.5 g，按“2.3” 項下方法制備6份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素峰面積RSD 分別為1.57%、1.93%、1.24%、1.13%、1.92%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批本品粉末（批號202009）6 份，每份0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密量取含毛蕊異黃酮苷1.0 mg、水仙苷1.2 mg、銀鍛苷0.3 mg、異鼠李素0.4 mg、芒柄花素0.3 mg 的對照品溶液1 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素平均加樣回收率分別為95.80%、98.08%、91.90%、94.66%、99.82%，RSD 分別為0.45%、0.42%、0.26%、0.64%、0.60%。

2.5 相對校正因子考察

2.5.1 計算方法 取“2.2” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以毛蕊異黃酮苷為內標，計算其他4 種黃酮的相對校正因子fk／s，公式為fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標含量，As為內標峰面積，結果見表2。

表2 各黃酮相對校正因子Tab.2 Relative correction factors for various flavonoids

2.5.2 耐用性試驗 本實驗分別考察了Waters e2695、Agilent 1260 色譜儀及 Welch LP-C18、Agilent ZORRA plus-C18、Venusil XBP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對相對校正因子的影響，結果見表3，可知均無明顯影響（RSD ＜2.0%）。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.3 不同體積流量對相對校正因子的影響 本實驗考察了體積流量0.3、0.5、0.8、1 mL／min 對相對校正因子的影響，結果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表4 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.5.4 不同柱溫對相對校正因子的影響 本實驗考察了柱溫25、30、35、40、45 ℃對相對校正因子的影響，結果見表5，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.5.5 不同質量濃度對照品溶液對相對校正因子的影響 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液適量，依次稀釋至0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08 mg／mL，考察它們對相對校正因子的影響，結果見表6，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表6 不同質量濃度對照品溶液對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different concentrations of reference solutions on relative correction factors

2.5.6 檢測波長對相對校正因子的影響 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液4 份，分別在252、254、256、260 nm 波長處檢測，考察它們對相對校正因子的影響，結果見表7，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

表7 不同檢測波長對相對校正因子的影響Tab.7 Effects of different detection wavelengths on relative correction factors

2.5.7 樣品含量測定 取3 批樣品，每批3 份，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、一測多評法計算含量，結果見表8。由此可知，2 種方法所得結果接近［相對平均偏差（RAD）＜2%］，表明一測多評法可用于本實驗含量測定。

表8 各黃酮含量測定結果（mg／g， n＝3）Tab.8 Results of content determination of various flavonoids（mg／g， n＝3）

3 討論

沙芪濃縮丸以沙蓬為君藥，黃芪為臣藥，兩者均含黃酮類成分［19-20］，具有抗炎、抗氧化、抑制糖尿病等作用［21-22］。首先，本實驗考察不同供試品溶液制備方法，包括提取方法（超聲、加熱回流）、提取時間（30、60、90 min）、提取溶 劑（90%、70%、40%甲醇及無水甲醇），以各成分提取率為指標，最終確定為90% 甲醇超聲提取60 min。然后，篩選不同流動相，包括甲醇-水（含0.2%甲酸）、乙腈-水（含0.2% 甲酸）、甲醇-水（含0.5%、0.4%、0.01% 磷 酸）、乙 腈-水（含0.5%、0.4%、0.01% 磷酸），發現水相中酸濃度較高時各成分分離度較好，色譜峰峰形明顯改善，最終確定為乙腈-水（含0.4%磷酸）。最后，采用DAD 檢測器在190～400 nm 波長處進行掃描，發現各成分在260、290 nm 處均有吸收峰，以前者更理想，最終確定為260 nm。

4 結論

本實驗建立一測多評法同時測定沙芪濃縮丸中毛蕊異黃酮苷、水仙苷、銀鍛苷、異鼠李素、芒柄花素5 種黃酮的含量，發現所得結果與外標法接近（相對偏差小于2%），可在相應對照品缺少或難以得到的情況下，以毛蕊異黃酮苷為內標實現含量測定的目的，從而為該制劑的質量控制提供參考。