HPLC 法同時測定五虎湯加味中6 種成分

于琳琳，王 婧，丁惠玲，鄭景珂，景曉平*

（1.上海市兒童醫(yī)院／上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，上海 200062； 2.杭州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江杭州 310053）

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病［1-2］，全球兒童發(fā)病率不斷上升，尤其是在發(fā)展中國家［3-4］，嚴(yán)重威脅患兒身心健康［5-7］，中醫(yī)藥治療本病臨床經(jīng)驗(yàn)豐富，療效顯著。五虎湯加味是在五虎湯基礎(chǔ)上結(jié)合甘草干姜湯加減成方，全方組成為麻黃、杏仁、石膏、桑白皮、細(xì)辛、黃芩、皂角刺、干姜、豆蔻、甘草，具有清肺化痰、止喘溫中功效，其中前者在哮喘、肺炎喘嗽治療過程中臨床療效顯著［8-10］，后者治療肺脾陽虛較多，故全方臨床應(yīng)用前景廣闊。

課題組前期研究表明，五虎湯加味能顯著改善哮喘患兒肺功能指標(biāo)，降低IgE、EOS 計(jì)數(shù)和部分炎癥因子水平，臨床療效顯著［11］；文獻(xiàn)［12-13］報道，該方可減輕哮喘小鼠肺組織中氣道炎癥。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時測定五虎湯加味中黃芩主要成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素，干姜主要成分6-姜辣素，細(xì)辛主要成分細(xì)辛脂素，甘草主要成分甘草酸的含量，以期為該方質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters2695 型高效液相色譜儀，配置2996PDA 檢測器、Empoer3 色譜工作站、自動進(jìn)樣器、四元梯度泵（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水器（杭州景元科技有限公司）；PTF-A500 型電子分析天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；MewClassic MS 精密天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；DKS-26 電熱恒溫水浴鍋（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠）；EYELA 冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司），SK-7210LHC 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 五虎湯加味組方藥材分別購于上海市兒童醫(yī)院、孫泰和國醫(yī)國藥館、杭州開心大藥房，經(jīng)杭州醫(yī)學(xué)院李元圓副教授鑒定為正品，憑證標(biāo)本保存于杭州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。黃芩苷（批號FY09B712）、黃芩素（批號FY12970510）、6-姜辣素（批號FY19B0601）、細(xì)辛脂素（批號FY19B0809）對照品均購于南通飛宇生物科技有限公司，純度≥98%；甘草酸（批號190720）、漢黃芩苷（批號191207）對照品均購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%。甲醇為色譜純（批號28.02.11），購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；其他試劑均為分析純；水為超純水（由Milli-Q 型超純水器制得）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇制成黃芩苷、漢黃芩苷質(zhì)量濃度分別為825.20、144.40 μg／mL 的貯備液Ⅰ，以及黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸質(zhì)量濃度分別為31.00、63.40、24.40、99.60 μg／mL 的貯備液Ⅱ，將上述2 種貯備液等量混合，即得（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸質(zhì)量濃度分別 為 412.60、72.20、15.50、31.70、12.20、49.80 μg／mL），置于4 ℃冰箱中避光保存。

2.1.2 供試品溶液 取炙麻黃4.5 g、石膏20 g、杏仁9 g、桑白皮9 g、黃芩9 g、細(xì)辛3 g、皂角刺4.5 g、干姜3 g、豆蔻2 g、甘草6 g，粉碎后過3號篩，精密稱取0.25 g，置于100 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL 甲醇，在80 ℃下回流提取2 次，每次0.5 h，合并2 次提取液，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 分別取缺細(xì)辛、缺黃芩、缺干姜、缺甘草的陰性樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相水（含0.1%甲酸）（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～15 min，45%～48% B；15～27 min，48%～60% B；27～43 min，60%～68%B；43～48 min，68%～71%B；48～55 min，71% B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長0～33 min 275 nm，33～40 min 280 nm，40～49 min 285 nm，49～55 min 250 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)算，不低于4 000，并且各成分分離度應(yīng)不小于3.0。

2.3 專屬性考察 精密吸取空白溶劑及對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，空白溶劑、溶液中雜質(zhì)不干擾測定；陰性樣品溶液在對照品相應(yīng)保留時間處無吸收，表明其他藥味對測定無影響，該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.1” 項(xiàng)下對照品溶液適量，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 日內(nèi)精密度 精密吸取同一份對照品溶液10 μL，同一天內(nèi)在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定5 次，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸峰面積RSD 分別為0.16%、0.27%、0.42%、1.72%、1.46%、0.69%，表 明該方法日內(nèi)精密度良好。

2.5.2 日間精密度 精密吸取同一份對照品溶液10 μL，每天在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定5次，連續(xù)3 d，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸峰面積RSD 分別為0.48%、0.55%、1.01%、1.62%、2.84%、1.04%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，于0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸峰面積 RSD 分別為2.29%、1.51%、1.53%、2.06%、1.90%、2.55%，表明溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批本品粉末6 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸含量RSD分別為1.65%、1.82%、1.75%、1.85%，1.92%、2.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品粉末0.125 g，共9 份，每3 份1 組，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度（分別為已知含量的80%、100%、120%）的對照品溶液，每個質(zhì)量濃度3 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸平均加樣回收率分別為93.14%、98.48%、99.09%、100.36%，98.86%、93.98%，RSD 分別為2.54%、2.43%、2.59%、2.78%，2.60%、2.78%。

2.9 樣品含量測定 取3 批樣品粉末，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行2份，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定2 次，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 討論

課題組前期采用HPLC-QTOF／MS 法對五虎湯加味進(jìn)行分析，鑒定出苦杏仁苷、麻黃堿、偽麻黃堿、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、桑根酮C、桑根酮D、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素、細(xì)辛脂素等化合物，根據(jù)其極性、酸堿性、含量等差異，建立包含2 種條件的HPLC 法分別測定上述成分含量［14-16］。本實(shí)驗(yàn)報道了黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸、6-姜辣素、細(xì)辛脂素的含量測定方法，后續(xù)將以乙腈-0.1%磷酸（含0.1%三乙胺）為流動相，測定苦杏仁苷、麻黃堿、偽麻黃堿等成分含量。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)各成分紫外吸收圖譜，選擇在275 nm波長處檢測黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素，280 nm 波長處檢測6-姜辣素，285 nm 波長處檢測細(xì)辛脂素，250 nm 波長處檢測甘草酸，實(shí)現(xiàn)了6 種成分含量的同時測定。在流動相篩選過程中，本實(shí)驗(yàn)考察乙腈-水（含0.1%甲酸）、甲醇-水（含0.1%甲酸）等系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以后者洗脫時色譜峰峰形最好，基線噪音最低。再考察不同體積流量、柱溫對各成分色譜峰分離度的影響，發(fā)現(xiàn)兩者微小變化對測定結(jié)果影響不大，表明該方法具有良好的耐用性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時測定五虎湯加味中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、細(xì)辛脂素、甘草酸的含量，該方法精密穩(wěn)定，適用性、可靠性良好，可用于該方質(zhì)量控制。