資癸益沖方對卵巢儲備功能下降大鼠卵巢組織鐵代謝及凋亡的影響

李建茹舒蒙蒙方育恩倪 萌馬惠榮宋翠淼*

（1.河北中醫學院基礎醫學院，河北 石家莊 050200； 2.河北中醫學院中西醫結合學院，河北 石家莊 050200； 3.河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 050200； 4.河北省中西醫結合生殖疾病協同創新中心，河北 石家莊 050200）

卵巢儲備功能下降是卵巢衰老或衰竭的前期狀態，是由卵巢內可募集的卵泡數量減少或可受精的卵母細胞能力下降所造成［1］。近年來，隨著社會經濟的發展、環境的改變及生育年齡的延后，卵巢儲備功能下降的發病率逐年上升，約10% 不孕和32%體外受精和胚胎移植周期失敗與卵巢儲備功能下降有關［2］。研究顯示，卵巢組織中鐵水平與卵巢儲備功能呈負相關［3-4］，體內鐵超載患者多伴隨卵巢功能減退［5］。課題組前期研究顯示，卵巢儲備功能下降大鼠卵巢的氧化應激反應加重［6］。研究證實，氧化應激的發生與鐵代謝異常有關［7］，而鐵代謝異常可影響抗氧化酶的合成，導致組織氧化損傷及細胞凋亡［8］。因此，卵巢組織鐵代謝異常可導致氧化損傷，造成卵巢儲備功能下降。

補腎法的代表方資癸益沖方是全國名中醫杜惠蘭教授20 多年來有效防治卵巢功能下降的經驗方，具有補腎扶脾、調補精血作用。前期研究顯示，資癸益沖方可改善卵巢儲備功能下降患者和模型大鼠的氧化應激水平，提高卵巢的儲備功能［6，9-10］。本實驗通過建立卵巢儲備功能下降大鼠模型，觀察資癸益沖方對其卵巢組織鐵代謝調節蛋白表達、細胞凋亡及卵巢儲備功能的影響，以期為中醫臨床治療卵巢儲備功能下降提供理論和實驗的依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性SD 大鼠50 只，體質量（300±20）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（遼）2020-0001，飼養于河北中醫學院科研中心，室溫（23±2）℃，通風良好，光照明暗各12 h，期間給予標準顆粒飼料、充足飲水，適應性喂養7 d，實驗動物使用許可證號SYXK（冀）2017-005，本實驗所涉及的相關操作均經河北中醫學院倫理委員會審查批準（批準號YXLL2021013）。

1.2 藥物

1.2.1 中藥 資癸益沖方（由熟地、枸杞子、當歸、白芍、山萸肉、女貞子、炙黃芪、黨參、白術、香附等組成）所用藥物為顆粒劑，購自神威藥業集團有限公司，按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表” 進行換算，配制成2.1 g／mL 的藥液，于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 西藥輔酶 Q10膠囊（國藥準字H19999132）購自上海上藥信誼藥廠有限公司，配制成0.47 mg／mL 的藥液備用；注射用環磷酰胺（CTX）（0.2 g／瓶，國藥準字H20160467）購自德國Baxter Oncology GmbH 公司，配制成10 mg／mL的藥液備用。

1.3 試劑 抗苗勒管激素（AMH）（批號HY-10140）、雌二醇（E2）（批號RG61812）、卵泡刺激素（FSH）試劑盒（批號RG11812）均購自天津九鼎醫學生物工程有限公司；TUNEL 試劑盒（批號11684817910）購自瑞士Roche 公司；轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）抗體（批號NB100-92243）購自美國Novus 公司；二價金屬離子轉運蛋白1（divalent metal ion transporter 1，DMT1）抗體（批號ab55735）、膜鐵轉運蛋白1（ferroportin 1，FPN1）抗體（批號ab239583）購自英國Abcam 公司。

1.4 儀器 酶標儀（南通邁迪檢測儀器有限公司，型號Versa Max）；電泳槽及電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYY）；顯微圖像分析系統（武漢千屏影像技術有限責任公司，型號HMIAS-2000）；電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號DY89-1）；恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司，型號SHA-B）；實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號CFX96）；凝膠成像儀（美國GE 公司，型號Image Quant LAS4010）。

2 方法

2.1 分組與造模 通過陰道脫落細胞涂片選取40只動情周期規律大鼠，隨機數字表法分為正常組、模型組、資癸益沖方組和輔酶Q10組，每組10 只。在課題組前期研究［6］基礎上，參考文獻［11］報道，通過一次性腹腔注射CTX（75 mg／kg）建立卵巢儲備功能下降大鼠模型。于造模后第2 天開始，每天上午8：00 進行陰道脫落細胞涂片，連續10 d，當陰道脫落細胞涂片出現動情周期紊亂或延長則提示造模成功。

2.2 給藥 造模成功后，資癸益沖方組灌胃給予14 g／kg 資癸益沖方顆粒劑溶液；輔酶Q10組灌胃給予3.15 mg／kg 輔酶Q10溶液；模型組和正常組灌胃給予等量蒸餾水，連續14 d。

2.3 取材 給藥結束后進行陰道脫落細胞涂片，所有大鼠禁食不禁水，在動情前期，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg／kg，麻醉處死大鼠，股動脈取血，快速無菌方法留取卵巢組織，將每只大鼠的左側卵巢保存于－70 ℃冰箱，右側卵巢放置于4%多聚甲醛中固定。

2.4 檢測指標

2.4.1 觀察大鼠動情周期變化 給藥結束后，每天上午8：00 進行大鼠陰道脫落上皮細胞涂片，于顯微鏡下觀察大鼠動情周期變化。

2.4.2 ELISA 法檢測大鼠血清AMH、E2、FSH 水平 將大鼠血液靜置30 min，離心，分離得血清。按照試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測定吸光度值并計算AMH、E2、FSH 水平。

2.4.3 HE 染色觀察卵巢組織各級卵泡數量 各組按照隨機數字表法選取6 只大鼠卵巢組織，石蠟包埋，切片，HE 染色，每張切片先于40 倍光學顯微鏡下觀察全部組織各級卵泡數量，再于100 倍鏡下觀察具體卵泡變化。

2.4.4 普魯士藍染色觀察卵巢組織鐵沉積 各組按照隨機數字表法選取6 張卵巢組織切片，常規脫蠟、水化，Perl’s 染色液染色20 min，核固紅試劑B 染核5 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察卵巢組織細胞藍色顆粒。通過Image J 1.8.0 圖像分析軟件測量并計算普魯士藍染色陽性面積占總面積的百分比。

2.4.5 TUNEL 法檢測卵巢組織細胞凋亡 取卵巢組織石蠟切片，按照TUNEL 試劑盒說明書步驟操作，加入3% H2O2-甲醇混合溶液，TUNEL 反應液和過氧化物酶37 ℃孵育，DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。各組按隨機數字表法選取6 只大鼠的卵巢組織石蠟切片進行TUNEL 染色，記錄每個視野下細胞核呈棕褐色表達的細胞數并計算凋亡指數，公式為凋亡指數＝陽性細胞數／總細胞數×100%。

2.4.6 Western blot 法檢測卵巢組織鐵代謝調節蛋白TFR1、DMT1、FPN1 的表達 提取卵巢組織蛋白，每孔上樣等量總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，充分洗膜后，應用ECL 化學發光法檢測，以β-actin 為內參，對目的蛋白分別進行灰度值分析。每組結果相同條件至少重復3 次并取平均值。

2.5 統計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，先進行正態分布和方差齊性檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗，計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 資癸益沖方對大鼠動情周期變化的影響 正常組大鼠的動情周期約為4 d，分別是動情期（無核角化細胞為主）、動情后期（角化細胞、有核細胞、白細胞三者共存）、動情間期（白細胞為主）、動情前期（有核細胞為主）。與正常組比較，模型組大鼠出現動情周期紊亂，動情間期延長；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠動情紊亂周期縮短，動情周期恢復，見圖1～2。

圖1 各組大鼠動情周期陰道脫落細胞美蘭染色（×100）Fig.1 Methylene blue staining of vaginal exfoliated cells of rats in each group during estrous cycle（×100）

圖2 各組大鼠動情周期變化曲線Fig.2 Estrous cycle change curves of rats in each group

3.2 資癸益沖方對大鼠血清AMH、E2、FSH 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清AMH、E2水 平降 低（P＜0.05），FSH 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠血清AMH、E2水平升高（P＜0.05），FSH水平降低（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠血清AMH、E2、FSH 水平無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清AMH、E2、FSH 水平比較（±s， n＝10）Tab.1 Comparison of serum AMH，E2 and FSH levels of rats in each group（±s， n＝10）

表1 各組大鼠血清AMH、E2、FSH 水平比較（±s， n＝10）Tab.1 Comparison of serum AMH，E2 and FSH levels of rats in each group（±s， n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.3 資癸益沖方對大鼠卵巢組織各級卵泡數量的影響 正常組大鼠卵巢組織可見原始卵泡、生長卵泡和黃體，顆粒細胞層排列緊密有序；與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織原始卵泡數、生長卵泡數及黃體數減少（P＜0.05），閉鎖卵泡數增多（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織原始卵泡數、生長卵泡數及黃體數增多（P＜0.05），閉鎖卵泡數減少（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織原始卵泡數、生長卵泡數、黃體數、閉鎖卵泡數均無明顯變化（P＞0.05），見表2、圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織HE 染色（×100）Fig.3 HE staining of ovarian tissue of rats in each group（×100）

表2 各組大鼠卵巢組織生長卵泡數、黃體數、閉鎖卵泡數比較（±s， n＝6）Tab.2 Comparison of the number of growing follicles，corpus luteum and follicular atresia in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝6）

表2 各組大鼠卵巢組織生長卵泡數、黃體數、閉鎖卵泡數比較（±s， n＝6）Tab.2 Comparison of the number of growing follicles，corpus luteum and follicular atresia in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.4 資癸益沖方對大鼠卵巢組織鐵沉積及細胞凋亡的影響 普魯士藍染色顯示卵巢組織鐵沉積主要發生在卵巢皮質，位于大的竇狀卵泡或黃體；普魯士藍顆粒可見于顆粒細胞、膜細胞和間質巨噬細胞的細胞質中。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織鐵沉積（普魯士藍染色陽性面積百分比）增加（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織鐵沉積減少（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織鐵沉積無明顯變化（P＞0.05），見圖4、表3。

圖4 各組大鼠卵巢組織普魯士藍染色（×200）Fig.4 Prussian blue staining of ovarian tissue of rats in each group（×200）

表3 各組大鼠卵巢組織鐵沉積及凋亡指數比較（%，±s， n＝6）Tab.3 Comparison of iron deposition and apoptosis index in ovarian tissue of rats in each group（%，±s，n＝6）

表3 各組大鼠卵巢組織鐵沉積及凋亡指數比較（%，±s， n＝6）Tab.3 Comparison of iron deposition and apoptosis index in ovarian tissue of rats in each group（%，±s，n＝6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

卵巢組織凋亡細胞呈現棕黃色，主要分布在卵泡顆粒細胞層、閉鎖卵泡及萎縮的黃體。正常組大鼠卵巢組織可見少量凋亡的顆粒細胞；與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織顆粒細胞、間質細胞凋亡數量增多，細胞凋亡指數升高（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織顆粒細胞凋亡數量減少，細胞凋亡指數降低（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織細胞凋亡指數無明顯變化（P＞0.05），見圖5、表3。

圖5 各組大鼠卵巢組織TUNEL 染色（×400）Fig.5 TUNEL staining of ovarian tissue of rats in each group（×400）

3.5 資癸益沖方對大鼠卵巢組織鐵代謝調節蛋白TFR1、DMT1、FPN1 表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達升高（P＜0.05），FPN1 蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，資癸益沖方組和輔酶Q10組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達降低（P＜0.05），FPN1蛋白表達升高（P＜0.05）；與輔酶Q10組比較，資癸益沖方組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），見圖6、表4。

圖6 各組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白電泳圖Fig.6 Protein electrophoresis of TFR1，DMT1 and FPN1 in ovarian tissue of rats in each group

表4 各組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白表達比較（±s， n＝3）Tab.4 Comparison of the protein expressions of TFR1，DMT1 and FPN1 in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝3）

表4 各組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1、FPN1 蛋白表達比較（±s， n＝3）Tab.4 Comparison of the protein expressions of TFR1，DMT1 and FPN1 in ovarian tissue of rats in each group（±s， n＝3）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

4 討論

中醫認為，腎藏精、主生殖，腎精包含先天之精和后天之精，先天之精是生育繁殖的最基本物質，與生殖和衰老密切相關；后天之精是水谷之精，滋養各組織器官并促進機體生長發育。卵巢屬先天之精，其功能發揮需靠后天水谷之精的滋養，先、后天之精不足，可導致卵巢失養，經孕失調，生育功能減退。故腎精虧虛是卵巢儲備功能下降的基本病機，補腎填精、健脾益氣養血是其治療方法［12-13］。資癸益沖方中熟地等為君藥，滋補肝腎，填精養血；女貞子、山萸肉等補腎肝養精血以資先天，黨參、白術等健脾益氣而資后天，共為臣藥；當歸、白芍調經養血理沖任，香附疏肝理氣，共為佐使，諸藥合用，使先后天同補，助精血以達資癸益沖之效。

環磷酰胺（CTX）是臨床上對卵巢功能損傷最大的化療藥物之一，可使卵巢細胞DNA 鏈斷裂，干擾蛋白質和核酸的合成，導致細胞凋亡，卵巢儲備減退［14］。研究證明，采用75 mg／kg CTX 一次性腹腔注射能夠成功建立卵巢儲備功能下降大鼠模型，此方法操作簡便且成功率高［15］。本實驗結果顯示，模型組大鼠動情周期紊亂，血清AMH、E2水平降低，FSH 水平升高，卵巢組織中各級生長卵泡數量減少，閉鎖卵泡增多，提示卵巢儲備下降，造模成功；資癸益沖方干預后，大鼠各項指標好轉，表明資癸益沖方可改善卵巢儲備功能下降。

氧化損傷是造成卵巢儲備功能下降的重要機制之一［16］。研究發現，鐵代謝異常致鐵超載可增加卵巢組織的氧化損傷，破壞“下丘腦-垂體-性腺軸”，造成卵巢衰老及功能減退［17-19］。課題組同期研究結果（暫未見刊）顯示，卵巢儲備功能下降大鼠卵巢組織鐵水平升高，結合普魯士藍染色推測卵巢儲備減退可能與卵巢鐵超載有關。TFR1、DMT1 和FPN1 是調節體內鐵代謝的重要因素，影響細胞鐵的吸收和釋放。鐵由TFR1 吸收進入細胞，通過DMT1 進行儲存［20］，并由跨膜蛋白FPN1釋放到血液中［21］。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達升高，FPN1 蛋白表達降低，表明細胞鐵吸收儲存增多而排出減少，從而導致卵巢鐵超載；資癸益沖方干預后，大鼠卵巢組織TFR1、DMT1 蛋白表達降低，FPN1 蛋白表達升高，卵巢組織鐵沉積和細胞凋亡程度減輕，卵巢儲備改善，這與課題組前期研究結果一致［6］。

綜上所述，資癸益沖方可明顯改善卵巢儲備功能下降大鼠的卵巢儲備功能，其機制可能與影響卵巢組織鐵代謝調節蛋白的表達，抑制鐵超載，減輕氧化損傷和細胞凋亡有關。