SIRT1 在復方苦參湯抑制潰瘍性結腸炎小鼠氧化損傷和炎性反應中的作用

林子棟，席作武，劉洪波

（1.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，河南 鄭州 450002； 2.河南省中醫院肛腸科，河南 鄭州 450002；3.南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473061）

潰瘍性結腸炎是臨床中常見的一種疑難腸病，以持續性和彌漫性炎癥為主要特征，臨床表現為腹瀉、腹痛、里急后重等，其病灶局限于結腸黏膜并向直腸近端延伸，其患病率呈不斷上升趨勢［1］。潰瘍性結腸炎的治療周期長、成本高，且纏綿難愈，增加了患結腸癌的風險。因此，尋找安全有效的潰瘍性結腸炎治療藥物顯得尤為必要［2］。近年來，中藥以其多成分和多靶點的特點，在該病治療中發揮重要作用，較西醫有療效佳、復發率低和副作用少等優點。

氧化損傷和炎癥反應是潰瘍性結腸炎的主要特征。沉默信息調節因子1（sirtuin1，SIRT1）作為一種組蛋白去乙酰化酶，在機體抵抗氧化應激和抑制炎癥反應中起重要作用［3］。研究表明在潰瘍性結腸炎小鼠體內SIRT1 表達明顯降低［4-5］；SIRT1表達上調可以減弱潰瘍性結腸炎小鼠腸道炎癥反應［6］。復方苦參湯是河南省中醫院肛腸科臨床常用的中醫外治方，是國家級知名專家席作武教授臨床治療潰瘍性結腸炎的經驗方，效果顯著，然而復方苦參湯對潰瘍性結腸炎的治療作用是否與SIRT1信號通路有關，目前并不清楚。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）建立小鼠潰瘍性結腸炎模型，并基于SIRT1 通路進一步明確復方苦參湯在治療潰瘍性結腸炎過程中潛在的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級小鼠70 只，雌雄各半，6～8 周齡，體質量（20±3）g，購自鄭州大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（豫）2019-022，實驗動物使用許可證號SCXK（豫）2019-022。小鼠在12 h／12 h 黑暗／光照循環，相對濕度（55±5）%，溫度（23±2）℃的標準實驗室進行飼養，自由采食和飲水。所有動物實驗操作均按照《國立衛生研究院實驗動物護理與使用指南》進行，并經河南中醫藥大學第二附屬醫院動物倫理委員會批準（編號PZ-HNSZYY-2021-007）。

1.2 試劑與藥物 復方苦參湯（大黃30 g、黃連30 g、黃芩30 g、苦參30 g、地榆30 g、紫花地丁30 g、蒲公英30 g、大青葉30 g、馬齒莧30 g、金銀花30 g、野菊花30 g、槐米30 g、白鮮皮30 g、黃柏30 g、芒硝30 g）由河南省中醫院藥劑科提供，經河南省中醫院焦偉杰副主任藥師鑒定為正品。復方苦參湯藥材加入10 倍量純水浸泡2 h，煎煮30 min，過濾后同法再次煎煮30 min，合并2 次濾液并濃縮至生藥量0.6 g／mL，置于4 ℃冷藏備用。DSS（批號Q9358）購自美國MP Biomedicals公司；SIRT1 抑制劑EX527（批號HY-15452）購自美國Med Chem Express 公司；多聚甲醛組織固定液（批號21200490）購自美國Sigma 公司；小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNFα）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（批號 ml002859、ml064292、ml037361、ml037361）購自上海酶聯生物科技有限公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號S0131S、P0012S）購自上海碧云天生物技術有限公司；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）探針（批號HR9069）購自北京百奧萊博科技有限公司；SIRT1、乙酰化核因子κB（Acetylated nuclear factor κB，Acetyl NF-κB）、錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，SOD2）、β 肌動蛋白（β-actin）抗體（批號 8469S、12629S、13141T、4970S）購自美國Cell Signaling Technology公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）抗體（批號AS09501a）購自美國Agrisera 公司。

1.3 儀器 RM2245 石蠟切片機、CM1850 冰凍切片機（德國Lecia 公司）；Shandon Citadel 2000 全自動脫水機（美國Thermo Scientific 公司）；TK-218 烘干機（湖北泰維科技實業股份有限公司）；5427R 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；SilverUVIpro 凝膠數字成像分析儀（英國UVItec 公司）；BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；Mini-PROTEAN 蛋白質電泳與轉膜系統（美國Bio-Rad 公司）；Spectra MaxM3 酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；Pannoramic 250 切片掃描系統（匈牙利3D HISTECH 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 70 只小鼠按隨機數字表法分為對照組，模型組，復方苦參湯低、中、高劑量組，柳氮磺吡啶組，復方苦參湯＋EX527 組，每組10 只，對照組給予正常飲用水，其余各組小鼠給予含3% DSS 的飲用水，每隔1 d 更換1 次，自由飲水7 d 以制備潰瘍性結腸炎模型，出現便血和體質量降低則提示模型復制成功。從造模第1 天開始，復方苦參湯組小鼠分別給予復方苦參湯低、中、高劑量（3、6、12 g／kg）灌腸；柳氮磺吡啶組灌胃給予300 mg／kg 柳氮磺吡啶；復方苦參湯＋EX527 組小鼠在給予12 g／kg 復方苦參湯灌腸的同時腹腔注射5 mg／kg EX527；對照組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉灌腸，每天1 次，連續7 d。

2.2 小鼠一般狀態評價與疾病活動指數（DAI）評分 每天給藥后30 min 觀察并記錄各組小鼠的精神狀態、毛發光澤度、大便性狀、體質量變化、便血情況及攝食飲水量，并進行DAI 評分。

2.3 樣本采集與處理 造模結束后，各組小鼠禁食12 h，次日眼球取血后采取頸椎脫臼法處死，剝離小鼠結腸組織，使用標尺測量各組小鼠結腸組織的長度，進行統計學分析。生理鹽水預冷后清除小鼠腸內糞便，取部分結腸組織固定于4%多聚甲醛中，進行蘇木素-伊紅（HE）染色處理；其余結腸組織凍存于－80 ℃冰箱備用。

2.4 免疫組化法檢測結腸組織中SIRT1 表達 取各組小鼠結腸組織石蠟切片，脫蠟及水化后高壓熱修復抗原，加3% H2O2于37 ℃孵育10 min，常規洗滌吸干后加入血清封閉，滴加SIRT1 抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜，常規洗滌后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，常規洗滌吸干后滴加DAB 工作液顯色，光學顯微鏡下拍照。隨機觀察每張切片中5 個不同視野，分別按照陽性細胞所占百分比和染色強度進行評分。陽性細胞百分比評分標準為0 分表示為陰性，1 分表示陽性細胞數不超過10%，2分表示陽性細胞數為11%～50%，3 分表示陽性細胞數為51%～75%，4 分表示陽性細胞數超過75%；染色強度評分標準為0、1、2 分分別對應無色、淡黃色和棕黃色，最終根據二者結果計算SIRT1 的表達積分。

2.5 結腸組織病理形態學觀察與評價 將固定的結腸組織常規脫水處理后采用二甲苯透明化，石蠟包埋，切片（5 μm），烤片脫蠟后常規HE 染色，封片，使用雙盲法在光學顯微鏡下觀察并記錄各組小鼠結腸組織的病理形態學情況，采集圖片。結腸損傷評分標準有潰瘍（0、1、2 分依次代表無潰瘍、潰瘍小于3 mm、潰瘍大于3 mm）、炎癥（0、1、2 分依次代表無、輕度、中度）、病變的深度（0、1、2、3 分依次代表無、黏膜下層、肌層、漿膜層）。

2.6 ELISA 法檢測結腸組織中炎性因子水平 分別稱取凍存于－80 ℃冰箱的各組小鼠結腸組織各50 mg，加入預冷的無菌PBS，充分勻漿后4 ℃、3 000 r／min 離心15 min，分離得上清液，參照ELISA 試劑盒說明書步驟，檢測各組小鼠結腸組織上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和MPO 活性。

2.7 DHE 染色法及比色法檢測小鼠結腸組織氧化損傷情況 將分離的結腸組織取部分制作冰凍切片（厚度40 μm），按照DHE 熒光探針檢測試劑盒說明書進行染色（濃度5 μmol／L）及清洗，熒光顯微鏡下觀察切片的染色情況，記錄熒光強度并計算平均值作為ROS 水平。依據試劑盒說明書，采用比色法測定小鼠結腸組織上清液中MDA 水平。

2.8 Western blot 法檢測結腸組織中Acetyl-NF-κB、CAT、SOD2 蛋白表達 取小鼠結腸組織研磨后加入RIPA 裂解液在冰上裂解，反復吹打使其松散，冰浴30 min 后4 ℃、12 000 r／min 離心15 min，提取蛋白上清液，按比例加入上樣緩沖液后于水浴鍋內100 ℃煮沸10 min 進行變性，BCA 蛋白定量法檢測其蛋白濃度。蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳后轉印至PVDF 膜上，用含有5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）于4 ℃下封閉2 h，加入一抗Acetyl-NF-κB（1∶1 000）、CAT（1∶1 000）、SOD2（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 充分洗滌3 次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST 充分洗滌3次，加入ECL 顯色液于PVDF 膜上后，在曝光儀中測定各組蛋白條帶的吸光度，用Image J 軟件分析條帶灰度值，通過與內參β-actin 的比值來表示目的蛋白相對表達。

2.9 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，數據以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析配合Tukey 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠一般狀態和DAI 評分的影響 與對照組比較，模型組小鼠有7只在第2 天出現糞便隱血呈陽性，在實驗第4 天則全呈現陽性，與此同時小鼠會伴有精神狀態萎靡、毛發凌亂缺乏光澤、大便稀溏以及體質量減輕，隨著時間的延長，這些癥狀表現得更加明顯，甚至會伴隨有血便的出現；柳氮磺吡啶組和復方苦參湯各劑量組小鼠上述癥狀得到不同程度的緩解；復方苦參湯＋EX527 組小鼠的一般狀態并未得到有效緩解。

如表1 所示，與對照組比較，隨著DSS 處理時間的延長，模型組小鼠DAI 評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，復方苦參湯各劑量組和柳氮磺吡啶組均減弱了DSS 引起的DAI 評分升高（P＜0.05，P＜0.01）；與同時間點復方苦參湯組高劑量組比較，復方苦參湯＋EX527 處理組小鼠DAI評分升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠DAI 評分的影響（分，±s， n＝10）Tab.1 Effects of Compound Sophorae Decoction on DAI score of UC mice（score，±s， n＝10）

表1 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠DAI 評分的影響（分，±s， n＝10）Tab.1 Effects of Compound Sophorae Decoction on DAI score of UC mice（score，±s， n＝10）

注：與同時間點對照組比較，**P＜0.01；與同時間點模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與同時間點復方苦參湯高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.2 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響 與對照組比較，模型組小鼠結腸長度縮短（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復方苦參湯各劑量組小鼠結腸長度增長（P＜0.05，P＜0.01）；與復方苦參湯高劑量組比較，復方苦參湯＋EX527 組小鼠結腸長度縮短（P＜0.01），見表2。

表2 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響（±s， n＝10）Tab.2 Effects of Compound Sophorae Decoction on colonic length of UC mice（±s， n＝10）

表2 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響（±s， n＝10）Tab.2 Effects of Compound Sophorae Decoction on colonic length of UC mice（±s， n＝10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

3.3 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織SIRT1 表達的影響 SIRT1 的陽性染色主要位于細胞核上。與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中SIRT1 表達減少，表達評分降低（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復方苦參湯各劑量組小鼠結腸組織SIRT1 表達增加，表達評分升高（P＜0.05，P＜0.01）；與復方苦參湯高劑量組比較，復方苦參湯＋EX527 組小鼠結腸SIRT1 表達減少，表達評分降低（P＜0.01），見圖1、表3。

表3 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織SIRT1 表達評分的影響（分，±s， n＝10）Tab.3 Effects of Compound Sophorae Decoction on SIRT1 expression scores of UC mice（score，±s， n ＝10）

表3 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織SIRT1 表達評分的影響（分，±s， n＝10）Tab.3 Effects of Compound Sophorae Decoction on SIRT1 expression scores of UC mice（score，±s， n ＝10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖1 各組小鼠SIRT1 表達情況（×400）Fig.1 Expression of SIRT1 in mice in each group（×400）

3.4 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織形態學的影響 如圖2 所示，對照組小鼠結腸組織黏膜光滑完整，排列整齊，未見炎癥細胞的浸潤；模型組小鼠結腸組織黏膜上皮結構遭到破壞，上皮細胞出現破損并可見炎性浸潤；柳氮磺吡啶和復方苦參湯各劑量組小鼠結腸組織黏膜上皮細胞保持相對完整，炎性浸潤明顯變少；EX527 處理則減弱了復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織黏膜組織的保護作用。此外，如表4 所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸病理學評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，復方苦參湯各劑量組小鼠結腸組織病理學評分降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復方苦參湯高劑量組比較，復方苦參湯＋EX527 組小鼠結腸組織病理學評分升高（P＜0.01）。

表4 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理學評分的影響（分，±s， n＝10）Tab.4 Effects of Compound Sophorae Decoction on histopathological scores of UC mice（score，±s， n＝10）

表4 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織病理學評分的影響（分，±s， n＝10）Tab.4 Effects of Compound Sophorae Decoction on histopathological scores of UC mice（score，±s， n＝10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖2 各組小鼠結腸組織形態學變化（×400）Fig.2 Histomorphological changes of colon in mice of each group（×400）

3.5 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織炎癥因子水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠結腸組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 及MPO 活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復方苦參湯各劑量組小鼠結腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平及MPO 活性降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復方苦參湯高劑量組比較，復方苦參湯＋EX527 組小鼠結腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β 水平及MPO 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），見表5。

表5 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠炎性因子水平的影響（±s， n＝10）Tab.5 Effects of Compound Sophorae Decoction on inflammatory factor levels of UC mice（±s， n＝10）

表5 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠炎性因子水平的影響（±s， n＝10）Tab.5 Effects of Compound Sophorae Decoction on inflammatory factor levels of UC mice（±s， n＝10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復方苦參湯高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.6 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織氧化應激指標的影響 與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中ROS、MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶和復方苦參湯各劑量組小鼠結腸組織ROS、MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復方苦參湯高劑量組比較，復方苦參湯＋EX527 組小鼠結腸組織ROS、MDA 水平升高（P＜0.01），見圖3、表6。

表6 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織氧化應激指標的影響（±s， n＝10）Tab.6 Effects of Compound Sophorae Decoction on colon oxidative stress indices of UC mice（±s， n＝10）

表6 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織氧化應激指標的影響（±s， n＝10）Tab.6 Effects of Compound Sophorae Decoction on colon oxidative stress indices of UC mice（±s， n＝10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖3 各組小鼠結腸組織ROS 水平（×400）Fig.3 ROS levels in mouse colon of each group（×400）

3.7 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠結腸組織SOD2、CAT 蛋白表達降低（P＜0.01），Acetyl NF-κB 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和復方苦參湯各劑量組小鼠結腸組織SOD2、CAT 蛋白表達升高（P＜0.01），Acetyl NF-κB 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；與復方苦參湯高劑量組比較，復方苦參湯＋EX527 組小鼠結腸組織SOD2、CAT 蛋白表達降低（P＜0.01），Acetyl NF-κB 蛋白表達升高（P＜0.01），見圖4、表7。

表7 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白表達的影響（±s， n＝10）Tab.7 Effects of Compound Sophorae Decoction on the colon protein expressions of Acetyl NF-κB，SOD2 and CAT of UC mice（±s， n＝10）

表7 復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白表達的影響（±s， n＝10）Tab.7 Effects of Compound Sophorae Decoction on the colon protein expressions of Acetyl NF-κB，SOD2 and CAT of UC mice（±s， n＝10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與復方苦參湯高劑量組比較，△△P＜0.01。

圖4 各組小鼠結腸組織Acetyl NF-κB、SOD2、CAT 蛋白條帶圖Fig.4 Bands of colon Acetyl NF-κB，SOD2 and CAT proteins of mice in each group

4 討論

潰瘍性結腸炎在中醫學中歸屬于“痢疾” “久痢” “腸澼” 等。席作武教授認為，潰瘍性結腸炎的發生不外乎嗜食肥甘厚味而生濕熱之邪，阻礙胃腸之氣血運行，久而及腎，治宜清熱解毒，除濕止痛。復方苦參湯具有清熱燥濕、涼血解毒、澀腸而止痢的功效［7-11］。本研究結果表明，復方苦參湯對DSS 誘導的小鼠潰瘍性結腸炎具有良好的治療作用。

SIRT1 作為一種去乙酰化酶，包括結腸在內的多種哺乳動物組織中均有廣泛表達，它通過調節蛋白的乙酰化水平來對下游靶基因的表達進行調控［12］。研究表明，SIRT1 低表達與潰瘍性結腸炎引起的結腸損傷相關，而上調SIRT1 表達則能有效緩解潰瘍性結腸炎小鼠的病理損傷［4］。本研究結果進一步證實，潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中SIRT1 表達較對照組降低，復方苦參湯處理后SIRT1 表達升高，然而SIRT1 抑制劑EX527 的干預不僅減弱了復方苦參湯誘導的SIRT1 表達升高，而且復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠體質量、結腸長度、DAI 指數、組織病理評分的保護作用也被抑制，提示復方苦參湯通過調控SIRT1 信號對潰瘍性結腸炎小鼠起保護作用。

炎癥因子的過量表達與潰瘍性結腸炎引起的腸道損傷密切相關。NF-κB 是誘導炎癥因子表達的重要轉錄因子，其轉錄活性受到乙酰化NF-κB p65 的調控，NF-κB p65 在310 位點賴氨酸殘基的乙酰化會促進p65 亞基入核，誘導炎癥因子的轉錄［13-14］。活化的SIRT1 會降低NF-κB p65 的乙酰化水平，從而抑制炎癥因子水平［15］。為了探究復方苦參湯是否通過調節SIRT1 信號來發揮抗炎作用，本研究采用SIRT1 抑制劑EX527 來進行干預，結果表明EX527 緩解了復方苦參湯對NF-κB 乙酰化水平的調控作用，其炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平也較復方苦參湯組升高。此外，MPO 活性的高低可直接反映腸道中炎性損傷的程度［16-17］。本研究結果表明，EX527 的使用減弱了復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸MPO 活性升高的抑制作用。這些結果提示，復方苦參湯通過激活SIRT1 信號來抑制潰瘍性結腸炎小鼠炎癥損傷。

氧化應激作為潰瘍性結腸炎發生與發展的另一重要因素，會引起ROS 水平升高，抗氧化酶CAT、SOD 活性降低，脂質過氧化物MDA 水平升高，當超過機體自由基的清除能力時就會對結腸組織造成破壞性損傷，同時會造成炎癥與組織損傷之間出現惡性循環［18-20］。本研究結果顯示，復方苦參湯處理降低了潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織ROS、MDA水平，升高了SOD2、CAT 蛋白表達，而EX527 干預減弱了復方苦參湯對潰瘍性結腸炎小鼠結腸氧化損傷的保護作用。

綜上所述，復方苦參湯通過激活SIRT1 信號對潰瘍性結腸炎起保護作用，而活化的SIRT1 減弱了潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織NF-κB 乙酰化水平，激活SOD2、CAT 蛋白表達，從而抑制炎性因子水平，減輕氧化損傷。