黃柏抗痛風活性部位篩選及其對腹膜炎小鼠的保護作用

魏夢佳麗馬 倩 張 芳王 婧譚曉斌*

（1.南京中醫藥大學附屬江蘇省中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028； 2.國家中醫藥管理局中藥釋藥系統重點研究室，江蘇 南京 210028； 3.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046）

痛風屬代謝性風濕病范疇，主要是由于人體內嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄障礙，導致血尿酸水平長期超過人體代謝上限，從而形成單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體，并沉積于關節和軟組織等處引起高尿酸血癥及痛風［1-2］。治療痛風的藥物主要有非甾體抗炎藥、糖皮質激素等，但以上幾類藥物多具有嚴重的副作用，如秋水仙堿具有腎毒性。目前藥物確實能控制病情發展，但存在緩解率低、復發率高、安全性差、長期療效不穩定、并發癥多等問題。因此，尋求更有效的治療方法和藥物迫在眉睫。

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendri chinensisSchneid.的干燥樹皮，習稱“川黃柏”，剝取樹皮后，除去粗皮，曬干［3］。黃柏具有抗痛風、免疫調節、抗炎抑菌、抗真菌、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用，其主要化學成分有生物堿類、黃酮類、酯類、甾醇類、微量元素等［4-6］，其中生物堿類是黃柏的主要有效成分，含量達3%以上，主要有小檗堿、黃柏堿、藥根堿、蝙蝠葛任堿、白瓜蔞堿、木蘭花堿、掌葉防己堿等［7-8］。但是對于黃柏抗痛風有效部位及其機制研究尚未闡明，因此，本研究擬通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和MSU 兩步刺激建立細胞痛風模型，考察黃柏不同極性部位的抗痛風活性，并研究其對小鼠體內抗痛風的藥效學及機制初探，旨在為黃柏下一步開發利用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器 ML304T 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；5428 型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；RE-5203 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D Ⅲ型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SPECTRA MAX 190 型酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；TH4-200 型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；HERA cell150i 型細胞培養箱（美國 Thermo Scientific 公司）；Class Ⅱ型生物安全柜（德國Labconco 公司）；DW-86L5788 型－80 ℃超低溫冰箱（海爾集團公司）；Gallios 流式細胞儀（美國Beckman 公司）。

1.2 試劑與藥物 黃柏（批號191217，江蘇華洪藥業科技有限公司），經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮。鹽酸小檗堿（純度≥86.7%，批號110713-201814，中國食品藥品檢定研究院）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（批號4291149，美國 eBioscience 公司）；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 試劑盒（批號DY008，美國R＆D 公司）；CCK-8 試劑盒（批號KH741，日本Dojindo 公司）；胎牛血清（批號0814，韓國DCELL Biologics 公司）；RPMI-1640 培養基（含雙抗）、DMEM 培養基（含雙抗）（批號20210310、20210502，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF，批號D1921，美國Peprotech 公司）；2-巰基乙醇、巰基乙酸酯、尿酸（批號M3148、70157、U2625，美國Sigma 公司）；中性紅（批號01087566，瑞士Adamas-beta 公司）；熒光抗體F4／80-APC、CD11b-Pacific Blue、Ly6G-PE（美國Biolegend 公司）。水為娃哈哈純凈水；石油醚等其他試劑均購自南京化學試劑股份有限公司。

1.3 實驗動物 清潔級雄性C57BL／6 小鼠，6～8周齡，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010，飼養于江蘇省中醫藥研究院，本實驗已獲得江蘇省中醫藥研究院倫理委員會批準。

1.4 黃柏不同極性部位制備 稱取黃柏飲片400 g，分別加入10、8 倍量70% 乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至75 mL，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇等體積萃取3 次，合并有機相，蒸干，加50 mL 乙醇溶解至含黃柏生藥量8 g／mL 備用，即得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。

1.5 尿酸鈉晶體制備 4 g 尿酸溶解在800 mL 1 mol／L NaOH 溶液中，加熱煮沸，緩慢攪拌至尿酸完全溶解，停止加熱，用HCl 將溶液pH 調節至7.2，室溫下攪拌使溶液逐漸冷卻，4 ℃過夜，5 000 r／min 離心5 min 以回收MSU 晶體，蒸餾水洗滌，小心收集晶體，40 ℃干燥24 h。每次實驗前將MSU 晶體研磨，180 ℃加熱2 h 滅菌，并保存在無菌環境中備用［9-10］。

1.6 MSU 誘導小鼠腹腔巨噬細胞痛風模型的建立 小鼠腹腔注射1 mL 3%巰基乙酸酯，4 d 后脫頸椎處死，75%乙醇浸泡消毒后轉移至生物安全柜中，腹腔注射5 mL DMEM 培養基，輕輕按摩腹部3 min，剪開腹腔，吸出腹腔灌洗液，2 000 r／min離心2 min，棄上清，用5 mL DMEM 培養基重懸，調整細胞密度為1×106／mL［11］。取上述細胞懸液接種于48 孔板中，每孔500 μL，2 h 后吸去上清，棄上層未貼壁細胞，加入新DMEM 培養基，得到貼壁的腹腔巨噬細胞，放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育過夜，1 μg／mL LPS 刺激5 h，再分別加入10 μmol／L 鹽酸小檗堿、500 μg／mL 黃柏醇提液及不同極性部位，給藥30 min 后給予100 μg／mL MSU 刺激18 h，ELISA 法檢測上清液中IL-1β、TNF-α 水平［12］。

1.7 MSU 誘導小鼠骨髓來源巨噬細胞（BMDM）痛風模型的建立 小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒后轉移至生物安全柜中，取出股骨與脛骨，置于裝有5 mL RPMI-1640 完全培養基（含2-巰基乙醇）的表面皿中，反復沖洗股骨與脛骨直至發白，收集培養基，2 000 r／min 離心2 min，棄上清，加入1 mL ACK 紅細胞裂解液裂解30 s，立即加入5 mL 培養基終止，2 000 r／min 離心2 min，棄上清，培養基洗2 次，重懸，調整細胞密度為2×106／mL。取上述細胞懸液12 mL，加 入50 ng／mL M-CSF，每孔2 mL 接種于6 孔板中，為培養的第0 天；第3 天，吸棄上清液，加入12 mL 含50 ng／mL M-CSF 的RPMI-1640 培養基；第5 天，直接加入12 mL 含50 ng／mL M-CSF 的RPMI-1640培養基；第7 天，吸棄一半上清液，加入12 mL 含50 ng／mL M-CSF 的RPMI-1640 培養基；第8 天，收集細胞，2 000 r／min 離 心2 min，棄上清，RPMI-1640 培養基重懸，并調整細胞密度為1×106／mL。取上述細胞懸液接種于48 孔板中，每孔500 μL，1 μg／mL LPS 刺激5 h，再分別加入10 μmol／L 鹽酸小檗堿、500 μg／mL 黃柏不同極性部位，給藥30 min 后給予100 μg／mL MSU 刺激18 h，ELISA 法檢測上清液中IL-1β、TNF-α 水平［12-13］。

1.8 腹腔巨噬細胞及BMDM 細胞存活率檢測 取“1.6” “1.7” 項下細胞懸液接種于96 孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育2 h，吸棄上清，用培養基洗3 次，加入陽性藥10 μmol／L 鹽酸小檗堿、500 μg／mL 黃柏醇提液及不同極性部位，繼續放入培養箱中培養24 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養2 h，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度（OD）值。

1.9 腹腔巨噬細胞吞噬能力檢測

1.9.1 黃柏活性部位吞噬中性紅能力 取“1.6”項下腹腔巨噬細胞，調整密度為1×106／mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL，培養2 h 后吸棄上清，去除未貼壁細胞，加入新培養基，放入37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育過夜，給予1 μg／mL LPS 刺激（空白組不給予），分別加入10 μmol／L 鹽酸小檗堿、500 μg／mL 黃柏正丁醇部位培養24 h，吸棄上清，加入200 μL 0.05%中性紅溶液，1 h 后吸棄上清，PBS 洗1～2 次，加入100 μL 細胞裂解液（50%乙醇、1%乙酸、49%水）釋放中性紅，搖床振蕩15 min后于酶標儀540 nm 波長處檢測光密度（OD）值，中性紅吞噬率＝OD給藥組／OD空白組［14-17］。

1.9.2 黃柏活性部位對巨噬細胞吞噬MSU 晶體能力的影響 按“1.6” 項下方法建立腹腔巨噬細胞痛風模型，MSU 刺激18 h 后吸棄培養基，PBS 洗2 次，熒光倒置顯微鏡下觀察，MSU 晶體清晰可見，確定每組細胞中吞噬MSU 細胞的百分比，共檢查4～5 個區域的至少100 個細胞，MSU 晶體吞噬率＝（給藥組吞噬MSU 細胞數量／空白組吞噬MSU 細胞數量）×100%［18-19］。

1.10 MSU 誘導小鼠腹膜炎模型的建立 小鼠隨機分為空白組、模型組、鹽酸小檗堿組及正丁醇部位低、中、高劑量組，其中鹽酸小檗堿組和正丁醇部位低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.02、5、10、20 g／kg，連續灌胃給藥3 d，空白組和模型組灌胃等量生理鹽水。給藥第3 天后，除空白組外均腹腔注射0.5 mL 含3 mg MSU 的PBS，6 h 后頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒后轉移至生物安全柜中，腹腔注射5 mL 冰PBS，輕柔按摩3 min，小心剪開腹膜，吸出腹腔灌洗液，2 000 r／min 離心2 min，吸棄上清液，ELISA 法檢測上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。下層細胞用5 mL PBS 重懸，計數，收集于流式管中，2 000 r／min 離心5 min，150 μL PBS 重懸，加入熒光抗體F4／80-APC、CD11b-Pacific Blue、Ly6G-PE 于冰上暗處染色20 min，直接加入2 mL PBS 洗滌，2 000 r／min離心5 min，棄上清，150 μL PBS 重懸，流式細胞儀檢測中性粒細胞募集程度［20-22］。

1.11 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，實驗數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃柏不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細胞及BMDM 細胞存活率的影響 黃柏不同極性部位組小鼠腹腔巨噬細胞及BMDM 細胞存活率與空白組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明黃柏不同極性部位對這2 種細胞均無毒性，見圖1。

圖1 黃柏不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細胞（A）及BMDM 細胞（B）存活率的影響（±s， n＝3）Fig.1 Effects of different polar parts of P.chinensis Cortex on viability of mouse peritoneal macrophages（A）and BMDM cells（B）（±s， n＝3）

2.2 黃柏不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1β、TNF-α 的影響 與空白組比較，模型組（1 μg／mL LPS 及100 μg／mL MSU 刺激）小鼠腹腔巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥鹽酸小檗堿組、黃柏醇提液及正丁醇部位組細胞IL-1β 水平均降低（P＜0.01），但各給藥組TNF-α 水平均無明顯變化（P＞0.05），見圖2。

圖2 黃柏不同極性部位對小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β、TNF-α 水平的影響（±s， n＝3）Fig.2 Effects of different polar parts of P.chinensis Cortex on IL-1β and TNF-α levels of mouse peritoneal macrophages（±s， n＝3）

2.3 黃柏不同極性部位對BMDM 細胞分泌IL-1β、TNF-α 的影響 與空白組比較，模型組BMDM 細胞上清液中IL-1β、TNF-水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸小檗堿組、石油醚部位和正丁醇部位組BMDM 細胞IL-1β 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），但各給藥組TNF-α 水平均無明顯變化（P＞0.05），見圖3，提示正丁醇部位為黃柏醇提液的活性部位。

2.4 黃柏活性部位對巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響 與對照組比較，正丁醇部位組和鹽酸小檗堿組巨噬細胞對中性紅的吞噬能力均減弱（P＜0.01）；給予LPS 刺激后，正丁醇部位組和鹽酸小檗堿組較模型組對中性紅的吞噬能力仍受到抑制（P＜0.01），見圖4。

圖4 黃柏活性部位對巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響（±s， n＝3）Fig.4 Effects of active fraction of P.chinensis Cortex on phagocytosis of neutral red in macrophages（±s， n＝3）

2.5 黃柏活性部位對巨噬細胞吞噬MSU 晶體能力的影響 巨噬細胞給予1 μg／mL LPS 及100 μg／mL MSU 刺激后，顯微鏡下觀察到大多數細胞吞噬MSU 晶體（圖5A）。與模型組比較，正丁醇部位組和鹽酸小檗堿組巨噬細胞吞噬MSU 晶體的能力受到抑制（P＜0.01），見圖5B，提示這可能是導致下游IL-1β 分泌減少的原因之一。

圖5 黃柏活性部位對巨噬細胞吞噬MSU 晶體能力的影響（±s， n＝3）Fig.5 Effects of active fraction of P.chinensis Cortex on phagocytosis of MSU crystal in macrophages（±s， n＝3）

2.6 黃柏活性部位對MSU 誘導小鼠腹膜炎模型的影響 如圖6A～6C 所示，與模型組比較，鹽酸小檗堿組和正丁醇部位各劑量組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.01），其中正丁醇部位高劑量組效果最明顯，但各給藥組TNF-α 水平均無明顯變化（P＞0.05）。如圖6D～6E 所示，與模型組比較，鹽酸小檗堿組和正丁醇部位中、高劑量組中性粒細胞募集程度降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 黃柏活性部位對MSU 誘導小鼠腹膜炎模型的影響（±s， n＝6）Fig.6 Effects of active fraction of P.chinensis Cortex on MSU-induced peritonitis mouse models（±s， n＝6）

3 討論

痛風是一種自身炎癥性疾病，是由感染或自身免疫性原因引起的周期性炎癥［23］。研究發現IL-1β在痛風發作的啟動過程中起著關鍵作用［24-25］。IL-1β 也被稱為內源性熱原，是一種炎癥性細胞因子，其產生受到3 個步驟的嚴格控制，首先是產生pro-IL-1β；接著是裂解前體pro-IL-1β 以產生活性IL-1β；最后IL-1β 被釋放到細胞外環境中，其中裂解pro-IL-1β 主要涉及激活caspase-1 復合物，這也是炎性小體最大的功能特征［26-27］。

炎性小體復合體通常包含胞質模式識別受體（PRR）、接頭蛋白（ASC／TMS1）和pro-caspase-1。在暴露于病原體相關模式分子（PAMP）或危險相關模式分子（DAMP）之后，炎性小體在胞質中完成組裝，激活caspase-1 以及后續裂解pro-IL-1β 和pro-IL-18，釋放活性炎癥因子IL-1β 和IL-18［28］。而TNF-α 屬于非炎性小體依賴性細胞因子，其釋放與炎性小體無關。

巨噬細胞被認為是啟動和驅動MSU 晶體引發炎癥的關鍵細胞［29-30］。因此，本實驗選用小鼠腹腔巨噬細胞及骨髓來源巨噬細胞建立痛風細胞模型。結果顯示，黃柏正丁醇部位可抑制IL-1β 的分泌，而其他部位均無明顯作用，提示正丁醇部位為黃柏抗痛風的活性部位，但各給藥組均不能降低TNF-α 水平，提示其抗痛風作用機制與炎性小體有關。

巨噬細胞是重要的免疫細胞之一，在宿主防御系統中起著至關重要的作用。因此，本實驗通過中性紅吞噬實驗及MSU 晶體吞噬實驗探索正丁醇部位對巨噬細胞吞噬能力的影響。結果顯示，各給藥組均可抑制巨噬細胞的吞噬能力，提示其抗痛風作用機制可能是降低細胞吞噬MSU 晶體的能力，從而減少IL-1β 等細胞因子釋放。

痛風炎癥的特征是MSU 晶體沉積導致中性粒細胞募集，因此本實驗通過小鼠MSU 腹膜炎模型考察腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，流式細胞術分析中性粒細胞募集程度的變化。結果顯示，與模型組比較，正丁醇部位各劑量組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6 水平降低，其中正丁醇部位高劑量組效果最明顯，但各組TNF-α 水平均無明顯變化；各給藥組F4／80－CD11b＋Ly6G＋標記中性粒細胞募集程度降低。

綜上所述，正丁醇部位為黃柏抗痛風活性部位，其抗痛風作用機制可能是通過降低細胞吞噬MSU 晶體的能力，從而減少IL-1β、IL-6 等細胞因子釋放，進而減少中性粒細胞募集程度，改善痛風癥狀。